BIOTECHNOLOGIA
Biotechnologia nie zajmuje się tylko nadprodukcją metabolitów pierwotnych czy wtórnych, ale także utylizacją czy przekształcaniem pewnych związków (najczęściej nie wytwarzanych przez dane organizmy, obce dla nich - ksenobiotyki).
Ksenobiotyki w organizmie człowieka są metabolizowane w wątrobie; najczęściej są one przekształcane w formy, które mogłyby być usunięte – czyli w formy rozpuszczalne w wodzie. Pierwszym etapem przekształcenia ksenobiotyku jest hydroksylacja (zwiększa polarność cząsteczki, ale nie zapewnia to bardzo dobrej rozpuszczalności związku w wodzie, a usuwanie mają zapewniać płyny ustrojowe, więc to za mało). Drugim procesem jest glukozylacja (u człowieka wstawianie kwasu glukonowego, pochodnej glukozy) – po pierwsze wprowadza ładunek (grupę, która ulega dysocjacji), a po drugie powoduje zwiększenie polarności cząsteczki.
*Kwasy żółciowe to nie ksenobiotyki tylko metabolity związków naturalnie występujących w organizmie.
Biotechnologia zajmuje się przekształceniami takich związków, może niepotrzebnych bakteriom czy grzybom które mają je przekształcać, ale potrzebnych innym organizmom. W ten sposób można uzyskiwać aminokwasy czy sterydy.
Do przekształcania ksenobiotyków niezbędna jest energia – trudno jest zapewnić w układach bezkomórkowych dostarczenie energii (dostarczanie ATP czy zredukowanych nukleotydów jest dosyć kosztowne, a te związki nie są odtwarzane). W organizmie nie trzeba ich dostarczać, bo są one odtwarzane.
W przypadku, gdy mamy do czynienia z jakimiś procesami, które nie wymagają energii, można je przeprowadzać przy pomocy samych enzymów, które izolujemy. Najłatwiej, gdy jest to enzym wyrzucany z komórki na zewnątrz; białek i innych substancji w mieszaninie zewnętrznej jest znacznie mniej niż w organizmie/komórce, można stosować np. wytrącanie siarczanem amonu (niewielkie stężenia soli powodują wysalanie białek – ułatwiają rozpuszczanie części białek trudno rozpuszczalnych ułatwiając powstawanie otoczki hydratacyjnej; wysokie stężenia soli powodują wytrącanie białek, niszcząc otoczkę hydratacyjną).
Jeżeli mamy do czynienia ze związkami, które normalnie w organizmach nie występują, musimy zapewnić, dla enzymu nie wydzielanego na zewnątrz, łatwe wnikanie substratu do wnętrza i łatwe opuszczanie komórki przez produkt (najłatwiej go wtedy izolować z takiego materiału; jeśli substancja znajduje się wewnątrz to na ogół trzeba doprowadzić do śmierci organizmu żeby ją stamtąd wyizolować).
Mamy tu opisane różne procesy, które mogą się odbywać z wykorzystaniem tego typu organizmów czy enzymów – mogą to być i reakcje redoks, najczęściej przeprowadzane z wykorzystaniem organizmów (bo najczęściej potrzebna jest do tego energia, jakiś czynnik redukujący, chyba że jest bezpośrednie przeniesienie np. wodoru na tlen atmosferyczny, bez żadnych pośredników; jeśli wymagane są zredukowane nukleotydy czy ATP to najefektywniejszy jest cały organizm). Mogą to też być reakcje utleniania np. alkoholi do odpowiednich ketonów (grupy hydroksylowe drugorzędowe) czy aldehydów i odpowiednich kwasów (grupy hydroksylowe pierwszorzędowe). Może to także być redukcja (uwodornienie wiązań, czyli likwidowanie wiązań podwójnych czy przekształcanie atomów węgla na wyższym stopniu utlenienia – kwasów, aldehydów czy ketonów do odpowiednich alkoholi). Może to być hydroliza – tego typu reakcje można przeprowadzać wykorzystując same enzymy, gdyż reakcje te nie wymagają energii. Izomeryzacja (przemieszczenie wiązań) tez bardzo często nie wymaga energii. Może też być kondensacja (przyłączanie jakiś innych cząsteczek), a także rozrywanie wiązań (np. dekarboksylacja).
Dlaczego tego typu procesów nie przeprowadza się chemicznie? (przeprowadza się jeżeli chemia jest tańsza) Podstawową zaletą układów biologicznych jest istnienie specyficzności jeśli chodzi o typ reakcji (enzymy zazwyczaj przeprowadzają jeden określony typ reakcji). Z drugiej strony jest regiospecyficzność – jeżeli mamy wiele takich samych grup funkcyjnych w cząsteczce to przekształceniu ulegają tylko określone grupy (np. utlenianie sorbitolu do sorbozy). Reakcje biologiczne na ogół cechują się stereospecyficznością – możliwe jest wykorzystywanie z mieszanin reacemicznych tylko jednego typu związku, istotnego z biologicznego punktu widzenia.
/na slajdach i na wykładzie racematy nazywane są reacematami, więc się dostosowałam/
Jednym ze starszych zastosowań enzymów czy organizmów do otrzymywania jakiś związków z mieszanin reacematów jest rozdzielanie mieszanin reacemicznych, a w zasadzie rozdzielanie mieszanin pochodnych związków nas interesujących (np. mieszaniny aminokwasów enzymy nie rozdzielą, wątpliwą możliwością jest nawet to, że jeden aminokwas będzie wiązany a drugi nie, bo trzeba by umieć wydzielać połączenie danego aminokwasu z enzymem). Na ogół do rozdzielania mieszanin wykorzystuje się więc pochodne związków, wykorzystując to, że pewne enzymy wykazują specyficzność w stosunku do jednej z tych pochodnych.
Na slajdzie mamy przykład, w którym rozdzielana jest mieszanina reacemiczna N-acetylopochodnych aminokwasu, czyli takich, w których grupa aminowa jest zestryfikowana kwasem octowym. Aminoacylaza Aspergillus oryzae hydrolizuje tylko wiązanie amidowe w przypadku pochodnych L-aminokwasów; drugi składnik mieszaniny reacemicznej nie ulega przekształceniu. Może on być zawracany po reacemizacji (doprowadzeniem do ponownego wytworzenia mieszaniny DL aminokwasów) i powtórnie wykorzystywany w tym procesie.
Reacemizację biologiczną można sobie wyobrazić w ten sposób, że mamy oksydacyjną deaminację a następnie przyłączanie grupy aminowej z powrotem – mogą powstawać D lub L-aminokwasy, o ile przyłączanie nie jest specyficzne.
Innym sposobem rozdzielania, przy czym w tej metodzie otrzymujemy D-aminokwasy a nie L, jest wykorzystywanie hydantoin – aminokwasów podstawionych cząsteczką mocznika. Reakcja jest dwustopniowa – z jednej strony w wyniku działania hydratoinazy rozszczepione zostaje wiązanie amidowe między grupą karboksylową a grupą amidową cząsteczki mocznika, dzięki czemu powstaje karbamoilopochodna. Następnie, w kolejnej reakcji hydrolizy, zostaje odszczepiony aminokwas (tu D-fenyloglicyna), amoniak i dwutlenek węgla. Tu także występuje zawracanie jednego ze związków, który może być powtórnie wykorzystywany po reacemizacji.
Innym sposobem otrzymywania aminokwasów jest rozdzielanie innego typu mieszanin reacemicznych.
Kaprolaktam jest w Polsce produkowany w Puławach, wykorzystywany w szeregu różnych syntez. Jego racemat, D,L-a-amino-e-kaprolaktam, w wyniku działania hydrolazy drożdży, oddaje lizynę. Forma D pozostaje nienaruszona i może być w wyniku reacemizacji z wykorzystaniem bakterii zawracana do powtórnej przeróbki.
W takich procesach mogą być również wykorzystywane dekarboksylazy: gdy mamy do czynienia z kwasem D,L-mezo-diaminopimelinowym, to dekarboksylaza powoduje powstanie L-lizyny, zaś formę D tego kwasu pozostawia.
Drugi węgiel, który wykazuje właściwości optyczne, powinien pozostawać w formie DL. A czemu nie pozostaje? Dekarboksylacja może następować z obu stron. Związek mezo ma mniej optycznych izomerów – niektóre się ze sobą pokrywają
Dekarboksylazy mogą być wykorzystywane przy dekarboksylacjach kwasów dikarboksylowych. Na slajdzie widzimy wykorzystanie do otrzymywania dwóch typów aminokwasów: L-alaniny i b-alaniny. Oba są niezbędne do życia, chociaż b-alanina nie jest aminokwasem białkowym – jest to związek potrzebny np. w biosyntezie lipidów, wchodzi w skład kwasu pantotenowego.
Innymi enzymami, które mogą być wykorzystywane do biosyntezy aminokwasów są liazy. Na slajdzie mamy podaną reakcję przy użyciu liazy z E.coli, wykorzystującej dikarboksykwas (fumaran) – po przyłączeniu amoniaku otrzymujemy kwas asparaginowy.
Są liazy przyłączające aminokwasy do pierścieni aromatycznych – np. jeżeli tym aminokwasem będzie alanina, otrzymujemy tryptofan, tyrozynę czy hydroksytyrozynę.
Mamy tu wykorzystanie układów redoks do produkcji octu z etanolu. Może on być także otrzymywany na drodze chemicznej poprzez utlenianie, ale otrzymujemy wtedy ocet stężony i należy go rozcieńczać, nie jest to to samo, co ocet spirytusowy. Ocet spirytusowy (winny ) otrzymywany jest z roztworów alkoholu (najczęściej wina) i zawiera dodatkowe aromaty. Proces jego powstawania jest dwuetapowy: pierwszy etap wymaga tylko obecności odpowiedniej dehydrogenazy i cytochromu c553 (może on być odtwarzany w obecności oksydazy cytochromowej). Drugi etap może być realizowany w dwojaki sposób: albo z wykorzystaniem odpowiednich nukleotydów (NADP+; aldehyd utleniany jest do kwasu octowego), albo podobnie do pierwszego układu, czyli w obecności cytochromu c553 i odpowiedniej oksydazy cytochromowej. Lepszy, z punktu widzenia biotechnologii, jest układ zawierający enzym 1,3 i 4 (bo nie trzeba dostarczać do układu NADP+).
*Stężony kwas octowy = kwas octowy lodowaty (bo temperatura przejścia ze stanu ciekłego w stan stały jest powyżej zera – około 4-5°zaczyna zamarzać).
Dlaczego alkohol jest 96%? Aby móc otrzymać bezwodny alkohol (absolutny) trzeba zastosować specjalne procedury, gdyż jest to mieszanina azeotropowa –dodajemy tlenek wapnia aby związać część wody (otrzymujemy nieczysty alkohol), lub benzen (ale zawsze troszkę go tam zostaje). Azeotrop ma niższą temperaturę wrzenia niż czyste rozpuszczalniki (woda i etanol). Spektralnie czysty alkohol można otrzymać dodając tlenek wapnia, a potem podgrzewa się z magnezem w obecności jodu. Taki alkohol wykorzystuje się np. do sporządzania widm w etanolu (nie może on wtedy zawierać domieszek dających widmo w pewnych zakresach).
Związek pośredni tej reakcji jest szkodliwy – alkohol metabolizowany w wątrobie przechodzi w aldehyd octowy, co może powodować np. marskość wątroby (bo aldehydy łatwo wchodzą w zasady Schiffa)
Innym związkiem, także produkowanym na drodze biotechnologicznej, jest kwas glukonowy (pochodna glukozy utleniona przy C1). W zależności od tego, jakim organizmem dysponujemy (A.niger czy G.suboxydans), glukoza może być utleniana albo w wyniku działania dehydrogenazy glukozowej (niezbędne NADP+), lub w wyniku działania oksydazy glukozowej (powstaje wtedy również woda utleniona, bo jeden atom tlenu służy do utlenienia grupy aldehydowej, a wodór jest przenoszony na tlen; wykorzystując katalazę można rozłożyć nadtlenek wodoru na wodę i na tlen, co nie wymaga nakładu energii). Powstaje lakton, który może ulegać hydrolizie samoistnie, lub może być do tego wykorzystywana hydrolaza (proces enzymatyczny jest szybszy).
*kwas glukuronowy – utleniony C6, glukanowy - C1 i C6
Mamy tu schemat otrzymywania kwasu askorbinowego z wykorzystaniem różnych układów redoks. Schemat nie jest w całości związany z procesami biotechnologii, wymaga także różnych procesów chemicznych (CH = reakcja chemiczna). Kwas askorbinowy można otrzymywać na różnych drogach, jedną z nich jest przekształcenie glukozy w sorbitol (polialkohol) i następnie utlenienie jednej z 6 grup hydroksylowych (utleniana jest ta w pozycji 5) – powstaje L-sorboza (odwrócenie liczenia atomów węgla – liczymy tak, aby atom najbardziej utleniony miał jak najniższą cyfrę porządkową; C5 sorbitolu w sorbozie staje się C2). L-sorboza w wyniku kolejnego utlenienia przekształca się w ketono-aldehyd: sorbozon, którego dalsze utlenienie prowadzi do otrzymania kwasu 2-oksogulonowego, przekształcanego dalej na drodze chemicznej w kwas askorbinowy.
Dwie pozostałe drogi prowadzą przez utlenienie, wprowadzenie grup ketonowych w pozycji 2 i 5, redukcję, także prowadząc do powstania kwasu 2-oksogulonowego.
Metodami biotransformacji można również transformować antybiotyki, np. b-laktamowe. Taka biotransformacja może z jednej strony być modyfikacją, która nie narusza struktury cząsteczki a prowadzi do zmiany aktywności; z drugiej strony może to być częściowa lub całkowita degradacja całej cząsteczki, prowadząca do braku aktywności.
W przypadku penicylin biotransformacja prowadząca do rozerwania wiązania b-laktamowego w cząsteczce prowadzi do całkowitej utraty aktywności antybiotyku (oporność szczepów bakteryjnych polega często na pojawieniu się tego typu aktywności; może też polegać na utracie powinowactwa do tego związku, co ciężko zrealizować, bo antybiotyk ten podobny jest do peptydu, który wiąże się z miejscem wiążącym enzymu w czasie transpeptydacji, czyli tworzenia wiązań poprzecznych w mureinie – zmiana powinowactwa do b-laktamów powodowałaby automatycznie zmianę powinowactwa do substratu).
W procesach biotransformacji biotechnologicznych wykorzystuje się obecność wiązania amidowego (estrowego) w cząsteczce penicyliny przy grupie aminowej związanej z C6 – grupa acylowa przy C6 może być odszczepiana i podstawiana inną grupą, co może zmieniać właściwości antybiotyku. Aby otrzymać pochodną, w której została odłączona reszta acylowa, stosuje się najczęściej acylazy lub amidazy (acylaza odszczepia resztę acylową, amidaza odszczepia resztę w wiązaniu amidowym). Acylazy stosujemy na ogół w pH zasadowym – otrzymujemy kwas 6-aminopenicylanowy.
Dlaczego pH procesu odłączania reszty acylowej powinno być zasadowe, skoro przy pomocy tych samych enzymów można otrzymać inne penicyliny stosując inne reszty acylowe w niskim pH (6-6,5)? W środowisku zasadowym kwas jest usuwany jako sól, brak produktu reakcji – reakcja dalej przebiega w kierunku tworzenia produktu. Gdy wprowadzamy kwas do środowiska, pH spada (środowisko się zakwasza) – gdy reakcja prowadzona jest w sposób ciągły trzeba dbać o charakter zasadowy.
Dlaczego reakcja odwrotna musi przebiegać w pH poniżej 7? Aby nie było soli, aby kwas był niezdysocjowany (aby dysocjacja była cofnięta), bo tylko taki może brać udział w reakcji estryfikacji. W takich układach można też wykorzystywać estry kwasu, bo nie mamy do czynienia wtedy z reakcją estryfikacji na zasadzie odwrócenia reakcji hydrolizy estrów, tylko transestryfikacji (produktem jest alkohol, tu H2O).
Drugim związkiem b-latamowym wykorzystywanym do otrzymywania półproduktów, które mogą być później wykorzystywane na drodze chemicznej do otrzymywania nowych antybiotyków, są cefalosporyny. Na drodze biotransformacji można otrzymać 3 typy półproduktów: kwas aminodeacetoksycefalosporanowy, kwas 7-aminocefalosporanowy i kwas deacetylo-7-aminocefalosporanowy.
Jeden z półproduktów otrzymujemy z metabolitu pośredniego na drodze biosyntezy cefalosporyny C, czyli produktu w którym grupa metylowa w pozycji 3 jeszcze nie została utleniona do odpowiedniej pochodnej hydroksylowej i nie została zacetylowana (dlatego deacetoksy, bo brak estru w pozycji 3). W wyniku działania acylazy zostaje odłączona reszta acylowa w pozycji C7 przy grupie aminowej.
Jeżeli mamy do czynienia z cefalosporyną C to nie możemy użyć acylazy (acylaza nie jest w stanie powodować jej deacetylacji). Najpierw trzeba zmienić resztę acylową tak, aby istniała acylaza, która będzie w stanie ją odszczepić. Przeprowadzamy oksydacyjną deaminację, powstaje ketokwas (pojawia się grupa karbonylowa zamiast aminowej), następnie utlenia się ten związek z wykorzystaniem nadtlenku wodoru – następuje odłączenie grupy karboksylowej, a taki związek może już być deacetylowany przez odpowiednią acylazę. Otrzymujemy kwas 7-AC. Jeżeli użyjemy acetylotransferazy z Bacillus subtilis, możemy odłączyć resztę octanową i otrzymać deacetylo-7-AC.
Mamy tu więc 2 grupy funkcyjne mogące być podstawiane innymi podstawnikami, które mogą zmieniać właściwości.
Na slajdzie mamy przykłady otrzymywania cefalosporyn na drodze chemicznej. Można to robić z wykorzystaniem acylaz i estrowych pochodnych kwasów (nie wolnych kwasów). Reszta acylowa zawsze będzie występowała w środowisku w postaci zjonizowanej i niezjonizowanej (zależy to od pH, w środowisku zasadowym będzie przeważała forma zjonizowana, w środowisku kwaśnym niezjonizowana). Gdy mamy do czynienia z estrami, to nie ma żadnej formy zjonizowanej, tylko forma niezjonizowana. W wyniku działania acylazy, przenoszącej z estru resztę acylową na grupę aminową, powstaje odpowiedni antybiotyk (w zależności od tego jaka to reszta powstaje inny antybiotyk o innych właściwościach).
Na slajdzie widzimy wzory wybranych steroidów roślinnych. Ze związkami steroidowymi związanych jest wiele biotransformacji – związki steroidowe, jeśli chodzi o organizm człowieka, są niezbędne jako składniki błon i jako hormony różnego typu (nie tylko płciowe, ale i sterydowe odpowiedzialne za metabolizm).
Związki steroidowe znajdują szerokie zastosowanie, np. sterydy, które wcale nie powodują przyrostu masy mięśniowej jako takiej, tylko obok tego przyrostu przyrost wody w tkance – gdy przestaje się je brać, ta masa mięśniowa zaczyna szybko znikać. Powodują m.in. wzrost agresywności.
Strukturą podstawową związków steroidowych jest struktura a-gonanu- układu czterocyklicznego (3 pierścienie sześciocykliczne, 1 pięciocykliczny, w sumie 17 węgli). W większości naturalnych steroidów ten układ pierścieniowy jest płaski (gdy zerwiemy jedno wiązanie podwójne otrzymamy 2 izomery: struktura płaska lub jeden pierścień może być pod kątem do 3 pozostałych; ale większość ma ten układ płaski, „złamane” są np. kwasy żółciowe).
Przedstawicielami steroidów są triterpeny (27 atomów węgla). Cholesterol występuje głównie u zwierząt (też u roślin, ale w dużo mniejszych ilościach, zwykle 2-3%). Na slajdzie mamy też przedstawicieli najbardziej popularnych steroli roślinnych: sitosterolu i sigmasterolu (od cholesterolu różnią się tym, że mają dodatkowo wprowadzoną resztę etylową w pozycji C24, a w przypadku sigmasterolu dodatkowo wiązanie podwójne w pozycji C22). Innym przykładem jest sapogenina steroidowa, metabolit wtórny występujący w roślinach, tu jest to diosgenina, w której łańcuch boczny cholesterolu został zamknięty w postaci dodatkowych 2 pierścieni.
Steroli roślinnych jest znacznie więcej (wiązanie podwójne może być w innych pozycjach, może być inna liczba węgli, stopień nasycenia). Najczęściej spotykanymi są sigmasterol i sitosterol.
Produkowane sterydy to głównie C19 steroidy i C21 steroidy (w ogóle nie mają łańcucha bocznego, tylko krótki łańcuch z 2-3 atomów węgla w pozycji C17)
Przedstawione zostały podstawowe procesy biotransformacji steroidów. To ogólny schemat, jakim reakcjom mogą ulegać steroidy: z jednej strony są to procesy redoks, prowadzące do zmniejszenia czy zwiększenia liczby wiązań podwójnych w cząsteczce (reakcja 2 prowadzi do redukcji wiązania podwójnego, czyli do otrzymania związku nasyconego). Mogą też być wprowadzane dodatkowe wiązania podwójne, które będą prowadziły do aromatyzacji pierścienia A. procesy redoks mogą prowadzić także do przekształcania grupy karbonylowej do grupy hydroksylowej, co w obecności wiązania podwójnego prowadzi jednocześnie do izomeryzacji tego wiązania. Dalsze procesy redoks mogą prowadzić do rozerwania pierścienia A.
Pierścień B w procesach biotransformacji praktycznie nie jest modyfikowany.
W przypadku pierścienia C może być wprowadzana w pozycji 11 grupa hydroksylowa albo grupa ketonowa, względnie wiązanie podwójne.
W pierścieniu D procesy biotransformacji mogą prowadzić do całkowitego usunięcia łańcucha bocznego z wprowadzeniem grupy ketonowej, względnie mogą prowadzić do rozerwania pierścienia i wytworzenia wiązania laktonowego, powstania pierścienia heterocyklicznego.
Mamy tu przedstawioną degradację łańcucha bocznego steroidów. Często jest tak, że różnego typu organizmy mogą przeprowadzać różnego typu reakcje. Usunięcie łańcucha bocznego i wprowadzenie grupy ketonowej, dla steroli prowadzi jednocześnie do utlenienia grupy hydroksylowej w pozycji 3 i jednoczesną izomeryzację tego wiązania. Te same organizmy mogą wprowadzać dodatkowe wiązania podwójne, dodatkowe grupy hydroksylowe, jaki doprowadzać do tego, że usunięcie łańcucha bocznego nie jest całkowite i mamy wtedy do czynienia z 20C steroidem, który w pozycji 17 ma przyłączoną grupę karboksylową. Inna grupa organizmów prowadzi do rozerwania pierścienia D w wyniku usunięcia łańcucha bocznego, co prowadzi do powstania układu laktonowego i jednoczesnej redukcji grupy hydoksylowej w pozycji 3.
Niektóre mikroorganizmy wprowadzają grupy hydroksylowe do układów steroidowych, przy czym proces ten zależeć może od specyficzności enzymu, który występuje w danym organizmie (wtedy konfiguracja grupy hydroksylowej zawsze jest identyczna); może to też zależeć od budowy cząsteczki (obecności w niej określonych grup funkcyjnych – obecność tych grup lub ich brak decyduje o konfiguracji wprowadzonej do cząsteczki grupy hydroksylowej).
Na slajdzie mamy to przedstawione na przykładzie grupy hydroksylowej w pozycji C11. W przypadku Cunnighamella blakesleeana i Culvularia lunata grupa hydroksylowa w pozycji 11 zawsze wprowadzana jest w pozycji b, natomiast w przypadku Rizopus nigricans zawsze w pozycji a, a dla Absidia orchidis w zależności od tego, czy w pozycji C17 jest grupa hydroksylowa czy nie to konfiguracja jest a (gdy nie ma grupy hydroksylowej w C17), albo b (gdy grupa hydroksylowa jest).
Podobnie ma się sytuacja w przypadku steroidów C21. Organizmy, które wprowadzają wiązanie podwójne w pozycji C1, przeprowadzają odłączenie łańcucha bocznego, mogą przeprowadzać wprowadzenie grup hydroksylowych w innych pozycjach itd. Wprowadzenie grupy hydroksylowej w pozycji C17 powoduje, że te mikroorganizmy są niezdolne do odszczepienia łańcucha bocznego.
Mamy tu schemat biotransformacji steroidów: substrat steroidowy albo chemicznie jest przekształcany do C21 steroidów, albo biotechnologicznie może być przekształcany do C19 steroidów. W zależności od tego, jakimi organizmami dysponujemy, C19 steroidy mogą być dodatkowo modyfikowane. Może być wprowadzana grupa hydroksylowa w pozycji 11, modyfikowane w łańcuchu bocznym (np. utleniane w C21, C17). Może też być wprowadzana grupa hydroksylowa w pozycji C9 a związek taki może być przekształcany w C21 na drodze chemicznej, na C9 może być wprowadzany atom chlorowca, dalej może być wprowadzane wiązanie podwójne do układu.
5
morcys1