Biochemia ćwiczenia
Należy pracować w rękawiczkach:
możliwość zakażenia i zatrucia substancjami badanymi lub używanymi odczynnikami (toksyny, bakterie, substancje radioaktywne)
możliwość zakażenia badanych materiałów przez osoby pracujące w laboratorium
Preparaty biochemiczne są nietrwałe możliwość namnażania bakterii
roztwory należy sterylizować
materiał biologiczny i roztwory przechowujemy w chłodni lub mrozimy
naczynia powinny być jednorazowe lub sterylizowane
Analiza chemiczna
• Jakościowa – określenie składu badanej substancji
• Reakcje charakterystyczne dla danego związku
• Ilościowa – określenie ilości badanej substancji
Stężenia
• mol/litr - M
• mikromol/litr - uM
• gram/litr – g/l
• miligram/mililitr – mg/ml
• C % = (masa substancji rozpuszczonej/masa roztworu) * 100%
Dysocjacja elektrolityczna
• NaCl → Na+ + Cl-
• H2O + H2O → H3O+ + OH-
Moc jonowa
gdzie: ci, zi - stężenie i ładunek jonu i,
Metody analityczne
Pierwszym etapem jest rozdział
• Badaną substancje można wydzielić przez:
• Zmiana mocy jonowej
• Wysolenie siarczanem amonu (dodatek rzędu 10-100% nasycenia ((NH4)2SO4
• Denaturacja - ogrzewanie lub dodanie czynnika denaturującego
• Filtracja lub wirowanie
• Chromatografia
• Elektroforeza
Chromatografia
• Polega na przepuszczaniu przez kolumnę roztworu białek. Kolumna jest to rura wypełniona złożem mającym taką właściwość że substancje w trakcie przepływu przez nią cieczy migrują z różną szybkością. Zbierając frakcje o określonej objętości dokonujemy rozdziału. Najpierw zbieramy substancje szybko migrujące przez kolumnę na na końcu te najwolniej migrujące
Kolumna chromatograficzna
Elektroforeza
Analiza ilościowa i jakościowa
• Metody ilościowe
• Analiza wagowa
• Miareczkowanie
• Spektrofotometria
• Metody elektrochemiczne, np. elektrody jonoselektywne
• Metody Jakościowe
• Reakcje charakterystyczne
•
• Obecnie podstawowe metody analityczne związane są ze spektrofotometria
• Spektrofotometria polega na pomiarze pochłaniania światła przez rozpuszczoną substancje.
• Światło ma charakter korpuskularno falowy co oznacza ze zachowuje się jak fale ale zarazem jak cząstki energii.
• Cząsteczki chemiczne maja ściśle określone poziomy energetyczne i mogą pochłaniać kwanty światła ściśle odpowiadające różnicom między tymi poziomami energetycznymi. Wynika z tego że dana substancja pochłania światło w bardzo specyficzny sposób,
• Jeśli naświetlimy barwny roztwór białym światłem zawierającym wszystkie kolory, to zaobserwujemy ze część światła została pochłonięta co powoduje zmianę barwy światła po przejściu przez badany roztwór.
• Roztwory miedzi maja kolor niebieski kobaltu różowy a niklu zielony.
• Różne substancje pochłaniają światło przy różnych długościach fali,
• alkohol etylowy pochłania fale świetlne w zakresie podczerwieni, na tej zasadzie działają profesjonalne mierniki stężenia alkoholu
• Białka i nukleotydy (ATP, kwasy nukleinowe) pochłaniają fale świetlne w zakresie UV nadfioletu
Spektrofotometria
• Są różne metody spektrofotometryczne, różniące się metodą pomiaru jak i długością fali przy której dokonujemy pomiarów.
• Można mierzyć bezpośrednio badaną substancje na przykład roztwory białek przy długości fali 280 nm lub też kompleksy barwne na przykład oznaczenia fosforanów metodą fiske subarowa lub białek przeprowadzając reakcje barwną z biuretem a nastepnie oznaczając stężenie tworzącego się barwnego kompleksu
• Można zbudować przyrząd , spektrofotometr wytwarzający światło monochromatyczne o jednej barwie , jednej długości fali a następnie zmieniać długość fali wytwarzanego światła.
• Jeśli takie światło przepuścimy przez badaną substancje i będziemy rejestrować zmiany pochłaniania tego światła w zależności od długości fali to otrzymamy widmo absorpcyjne danej substancji.
• Ponieważ wiadomo co jak absorbuje światło to z takiego widma można zorientować się co zawiera badana próbka. I tak białka absorbują w nadfiolecie przy długości fali ok. 280 nm (UV) a kwasy nukleinowe przy 260 nm (UV). Takie widma pozwalają określić skład i stężenie zawartych w roztworze substancji.
Spektrofotometr
Widmo absorpcyjne
Widmo jest to graficzny zapis zmian wartości absorbancji w zależności od długości fali przechodzącej przez badany roztwór. Głównymi parametrami widma są:
a - położenie pasm (wartość długości fali przy których na widmie można wyróżnić maksima; lmax)b - molowy (lub właściwy) współczynnik absorpcji związany z danym maksimum.
Transmitancja i absorbancja
Jeśli badany roztwór pochłonie 90% promieniowania o danej długości fali, to powiemy, że jego transmitancja wynosi 10%, zaś absorbancja będzie wynosić lg(100/10)=1
Prawo Lamberta Beera
A = e·c·l
c =A/(e*l)
Ponieważ l = 1cm można zapisać c =A/e
e - molowy współczynnik absorpcji, równy liczbowo absorbancji, która wystąpiłaby, gdybyśmy mierzyli w danych warunkach roztwór o stężeniu 1 mol/dm3 przy grubości warstwy równej 1 cm;
c - stężenie mierzonego roztworu w mol/dm3;
l - grubość warstwy roztworu w cm.
• Najczęściej używa się wspólczynnika absorpcji wyrażonego w jednostkach w jakich wyrażamy stężenia badanych substancji. Dla białek są to mg/ml a nie mole
Prawo addytywności absorpcji
• Absorpcja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:
• A = A1 + A2 + … An
• Gdzie: A1, A2, …, An są to absorbancje poszczególnych składników.
Pomiary spektrofotometryczne
• Najczęściej pomiary prowadzi się w kuwetach pomiarowych o długości drogi optycznej 1 cm, często kuwety nie są symetryczne i należy wkładać je do spektrofotometru we właściwy sposób
• Kuwety muszą być wykonane z materiału nie pochłaniającego promieniowania w zakresie długości fali przy których dokonujemy pomiaru.
• Dla nadfioletu (UV) używamy tylko kuwet kwarcowych oznaczonych literą Q, kuwety plastikowe lub szklane pochłaniają promieniowanie co uniemożliwiłoby pomiary
• Najprościej byłoby zmierzyć absorpcje podzielić przez współczynnik absorpcji i odczytać stężenie. W praktyce jest to niemożliwe bo roztwory pochłaniają światło w niespecyficzny sposób na skutek zmętnienia co więcej zawierają zanieczyszczenia np. ATP związek chemiczny bardzo mocno pochłaniający promieniowanie w zakresie nadfioletu (UV)
• Posługujemy się zmodyfikowanym wzorem do oznaczania stężenia
Abs(specyficzna) –Abs (niespecyficzna)
• C= ---------------------------------------
• współczynnik absorbcji
• Często oznaczamy nie bezpośrednio daną substancje a powstający w reakcji z nią barwny związek w takich wypadkach należy zastosować krzywą wzorcową gdyż reakcja barwna może zachodzić w różnym stopniu (odczynniki się starzeją)
• Przygotowujemy roztwór jak najbardziej zbliżony do roztworu badanego a następnie przygotowujemy kilka próbek zawierających mierzoną substancje o wzrastających stężeniach. dodajemy mierzoną substancje po zmierzeniu absorpcji rysujemy zależność absorpcji od stężenia i otrzymujemy krzywą wzorcową.
• Krzywe wzorcowe
• Roztwory wzorcowe powinny mieć podobny skład do próbki
• Krzywa wzorcowa powinna składać się co najmniej z czterech punktów
• Stężenia roztworów wzorcowych powinny być zbliżone do stężenia badanej próbki
• 1. Struktura pierwszorzędowa - czyli najniższy poziom organizacji strukturalnej cząsteczki jest wyznaczona przez sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Jest ona uwarunkowana jeszcze zanim zostanie zsyntetyzowany łańcuch polipeptydowy, gdyż informacja o kolejności aminokwasów w cząsteczce białka jest zakodowana w DNA, w postaci sekwencji nukleotydowej. Dzięki procesom transkrypcji, a później translacji sekwencja nukleotydowa zostaje odczytana w trakcie syntezy odpowiedniego polipeptydu.
• Czy mutacje są potrzebne?
• 2. Struktura drugorzędowa - są to typy regularnego ułożenia głównego łańcucha polipeptydowego stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Odkryto dwa podstawowe, regularne układy drugorzędowe występujące powszechnie w strukturze białek. Są to struktury a -helisy i b -harmonijki.
a -helisa
Struktura a -helisy ma kształt cylindra. Ciasno spleciony łańcuch główny polipeptydu tworzy centralną część cylindra, natomiast boczne łańcuchy reszt aminokwasowych wystają na zewnątrz w ułożeniu helikalnym.Struktura a -helisy jest stabilizowana wiązaniami wodorowym grup NH i CO głównego łańcucha. Grupa CO każdego aminokwasu wiąże się wiązaniem wodorowym z grupą NH, aminokwasu odległego do przodu o cztery reszty aminokwasowe i leżącego bezpośrednio nad nią. Rezultatem tego jest fakt, że wszystkie grupy CO i NH łańcucha głównego są połączone wiązaniem wodorowym.
Budowa a-helisy
Struktura b -harmonijki (b -kartki)
Struktura b -harmonijki (b -kartki) - W odróżnieniu od cylindrycznej struktury a -helisy, cząsteczka polipeptydu przyjmuje kształt, prawie całkowicie rozciągnięty.
• W uformowaniu struktury b -harmonijki, może brać udział więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy.
Struktura trzeciorzędowa
Czynniki stabilizujące strukturę trzeciorzędową białek
Wiązania wodorowe
Oddziaływania hydrofobowe
Wiązania jonowe
Kowalencyjne mostki dwusiarczkowe
Oddziaływania międzycząsteczkowe
Struktura czwartorzędowa
• Struktura czwartorzędowa powstaje po przez łączenie się kilku podjednostek białkowych.
• Stabilizują ją te same siły co strukturę trzeciorzędową
Krwinki czerwoneNajbardziej znane elementy morfotyczne krwi to krwinki czerwone, czyli erytrocyty. W jednym milimetrze sześciennym znajduje się średnio 5,4 miliona erytrocytów u mężczyzn i 4,8 miliona u kobiet.Ich główną rolą jest przenoszenie tlenu z płuc do tkanek. Te funkcje zapewnia obecność hemoglobiny - czerwonego barwnika krwi. Hemoglobina składa się z białka - globiny - oraz z czterech cząsteczek hemu. W hemie ważny jest atom żelaza, który wiąże się z jedną cząsteczką tlenu, tworząc oksyhemoglobinę. Żelazo posiada tę zdolność jedynie na drugim stopniu utlenienia; karboksyhemoglobina, tworząca się z połączenia hemu z tlenkiem węgla. Ten ostatni związek wypiera tlen z oksyhemoglobiny, czyniąc hemoglobinę bezużyteczną.
Krwinka
Budowa hemoglobiny
Hem
• Cztery wiązania koordynacyjne atomu żelaza wiążą się z 4 azotami grup pierścieni pirolowych piąte z tlenem a szóste z białkiem przez pierścień imidazolowy histydyny
•...
marek.po