Zastosowanie reakcji minisekwencjonowania do oznaczania przynależności halogrupowej mitochondrialnego DNA.pdf

ARCH. MED. SĄD. KRYM., 2008, LVIII, 212-217 pRACE pogLĄDowE

Patrycja Daca, Marta Mielnik, Urszula Rogalla, Katarzyna Skonieczna,

Katarzyna Linkowska, Tomasz Grzybowski

Zastosowanie reakcji minisekwencjonowania do oznaczania

przynależności haplogrupowej mitochondrialnego DNA

The application of minisequencing reactions for haplogroup assignment

of mitochondrial DNA

Z Katedry Medycyny Sądowej UMK w Toruniu, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera

w Bydgoszczy

Kierownik: prof. dr hab. med. K. Śliwka

w ostatnim czasie obserwuje się wzrost zainteresowa-

nia polimorfizmem jednonukleotydowym (ang. Single

Nucleotide polymorphisms – SNps) mitochondrialne-

go DNA (mtDNA), nie tylko w badaniach populacyj-

nych, ale również w genetyce sądowej. Ciągły rozwój

technik biologii molekularnej oraz powiększający się

zasób wiedzy filogenetycznej umożliwiają coraz szyb-

sze i dokładniejsze oznaczanie dużej liczby SNps

w obrębie genomu mitochondrialnego. Spośród

technik stosowanych do analizy SNps na szczególną

uwagę zasługuje metoda minisekwencjonowania.

Z uwagi na wysoką czułość tej metody i szybkość

wykonywanych nią oznaczeń, jest ona coraz częściej

stosowana w laboratoriach genetyczno-sądowych

na całym świecie. Niniejsza praca stanowi przegląd

istniejących systemów minisekwencjonowania stoso-

wanych do oznaczania przynależności haplogrupo-

wej mtDNA z populacji Europy, Azji wschodniej oraz

u rdzennych Amerykanów.

SNps in mitochondrial DNA. Among the SNp typing

techniques, due to its high sensitivity and promptness

of determinations, minisequencing appears to

be one of the fastest and most frequently applied

methods in forensic laboratories. This review presents

currently available minisequencing systems used for

haplogroup assignment of mtDNA in European, East

Asian and Native American populations.

Słowa kluczowe: mitochondrialny DNA, filo-

geografia, polimorfizmy jednonukleotydowe,

minisekwencjonowanie

Key words: mitochondrial DNA, phylogeog-

raphy, single nucleotide polymorphisms,

minisequencing

wSTęp

Analiza sekwencji mitochondrialnego DNA

stała się jednym z wartościowych narzędzi

w badaniach genetycznych przeprowadzanych

dla potrzeb wymiaru sprawiedliwości. Za sprawą

dużej liczby cząsteczek w komórce oraz wyso-

kiej odporności na degradację, mitochondrialny

DNA stał się szczególnie użytecznym markerem,

stosowanym do badań śladów biologicznych

zawierających zdegradowany materiał gene-

tyczny oraz w przypadkach identyfikacji ofiar

In the last few years, one could observe an increased

interest in mitochondrial DNA (mtDNA) single

nucleotide polymorphisms (SNps) as a result of

their numerous applications in population genetics

and forensic science. Continuous progress in

molecular technologies together with an increasing

body of phylogenetic knowledge, based mainly on

complete mitochondrial genome sequencing, allows

both for selection and accurate typing of many

Nr 4 213

przestępstw czy katastrof [1, 2]. Z kolei duża

zmienność mtDNA wewnątrz populacji wy-

nikająca z około dziesięciokrotnie wyższego

tempa mutacji w porównaniu z jądrowym DNA,

a także brak rekombinacji i dziedziczenie w linii

żeńskiej czynią z mtDNA doskonały marker do

badań antropologicznych i ewolucyjnych [2, 3].

Analiza krótkiego fragmentu cząsteczki DNA

(regionu kontrolnego) pozwala wykazać różnice

pomiędzy osobami, z kolei analiza sekwencji

całego genomu dostarcza informacji na temat

ewolucyjnego pochodzenia ludzkości oraz

szlaków migracji człowieka współczesnego [2,

4]. w badaniach filogenetycznych haplotypy

mtDNA o określonym wzorze sekwencji, odzie-

dziczonym od wspólnego przodka, skupione są

w monofiletyczne grupy określane mianem kla-

dów bądź haplogrup, definiowanych za pomocą

określonych polimorfizmów regionu kodującego

w powiązaniu z charakterystycznymi wariantami

regionu kontrolnego (HVS I oraz HVS II). Dane

pochodzące wyłącznie z sekwencjonowania

regionu kontrolnego, a zwłaszcza z jego wy-

branych fragmentów, nie zawsze wystarczają

do określenia przynależności haplogrupowej

mtDNA. przykładowo, większość podgrup

w obrębie najczęstszej w Europie haplogrupy

H definiowana jest poprzez mutacje regionu

kodującego, a nie kontrolnego [5]. Dodatko-

wo szybkie tempo substytucji zachodzących

w regionie kontrolnym oraz zjawisko homoplazji

(pojawianie się równoległych mutacji oraz re-

wersji) mogą prowadzić do mylnej interpretacji

uzyskanych wyników, na przykład notowany

w populacjach słowiańsko-języcznych haplotyp

HVS I/HVS II 16311C-263g-315.1C oraz jego po-

chodne mogą należeć zarówno do haplogrupy

H, jak i HV3 [6, 7].

Rozdzielczość analiz można zwiększyć po-

przez sekwencjonowanie pełnych genomów mi-

tochondrialnych. w ostatnim czasie dokonał się

bardzo znaczący postęp w dziedzinie genomiki

mitochondrialnej – opublikowano tysiące sek-

wencji pełnych genomów z populacji wszystkich

kontynentów, co pozwoliło na stosunkowo pre-

cyzyjną rekonstrukcję filogenezy ludzkiego mtD-

NA na skalę globalną. Zebrania i podsumowania

dotychczasowych danych na ten temat dokonali

w ostatnim czasie m.in. van oven i Kayser [8].

Niestety sekwencjonowanie pełnych genomów

jest nadal kosztowne i stosunkowo czasochłon-

ne, toteż wysiłki wielu zespołów badawczych,

zainteresowanych określaniem przynależności

haplogrupowej mtDNA, skoncentrowały się na

selekcji i ograniczonym typowaniu markerów

SNps. Doskonałym ich źródłem jest kodujący

region mtDNA, zwłaszcza w sytuacji, kiedy

znana jest filogeneza głównych haplogrup i pod-

haplogrup mitochondrialnych. określanie spe-

cyficznych haplogrupowo wariantów SNps w ob-

rębie regionu kodującego w znaczący sposób

poprawiło rozdzielczość badań populacyjnych

i identyfikacyjnych. wzrost zainteresowania

markerami SNp wiąże się również ze znacznie

szybszym i łatwiejszym w stosunku do tradycyj-

nych metod sekwencjonowania generowaniem

danych oraz stosunkowo łatwą implementacją

technologii w laboratorium. ponadto dla aplikacji

sądowych istotne znaczenie ma fakt, iż analizy

SNps mogą być przeprowadzane na bardzo

krótkich amplikonach, a zatem również w przy-

padku częściowej degradacji pozyskanego ma-

teriału biologicznego [3]. Istnieje szereg nowo-

czesnych metod umożliwiających wykrywanie

polimorfizmów jednonukleotydowych (SNps),

takich jak ilościowy pCR w czasie rzeczywistym

z zastosowaniem molekularnych sond TaqMan,

oligunukleotydowa reakcja ligacji (oLA) czy też

spektrometria masowa (MALDI-ToF). Jednakże

zarówno dla potrzeb sądowych, jak i populacyj-

nych, istotne znaczenie mają nie tylko szybkość

wykonywanych analiz, ich wysoka czułość i po-

wtarzalność, ale także stosunkowo niskie koszty

[3, 4, 9]. Narzędziem idealnie spełniającym te

wymagania jest reakcja minisekwencjonowania.

Jest ona oparta na zastosowaniu nieznakowa-

nego startera zaprojektowanego tak, by miejsce

mutacji bezpośrednio przylegało do jego końca

3’. w kolejnym etapie reakcji starter jest wydłuża-

ny przez pojedynczy, znakowany fluorescencyj-

nie dideoksynukleotyd. Każdy ze stosowanych

ddNTps wyznakowany jest innym barwnikiem

fluorescencyjnym, dzięki czemu możliwe jest

rozróżnienie poszczególnych pozycji nukleoty-

dowych. Zaletą reakcji minisekwencjonowania

jest możliwość detekcji wielu SNps jednocześnie

w reakcji multipleksowej. Do końca 5’ startera

przyłączony jest wówczas różnej długości tzw.

„ogon” poli T, który pozwala na łatwy rozdział

produktów poprzez elektroforezę kapilarną [3,

4, 9, 10].

oKREŚLANIE pRZYNALEżNoŚCI

HApLogRUpowEJ Z wYKoRZYSTANIEM

REAKCJI MINISEKwENCJoNowANIA

Częstości różnych haplogrup mitochondrial-

nego DNA wykazują znaczne zróżnicowanie

kontynentalne, przypisywane działaniu dryfu

genetycznego oraz selekcji naturalnej. Dużą

ZASToSowANIE REAKCJI MINISEKwENCJoNowANIA

214 Nr 4

różnorodność obserwuje się również wewnątrz

haplogrup w obrębie poszczególnych populacji,

przy czym najwyższy poziom osiąga ona w po-

pulacji afrykańskiej. System minisekwencjono-

wania stosowany do klasyfikacji haplogrupowej

powinien uwzględniać filogeograficzne zależ-

ności, tj. powinien być skonstruowany w taki

sposób, aby umożliwić dokonanie klasyfikacji

mtDNA w obrębie populacji danego kontynentu

lub jego części.

Zestaw specyficznych haplogrupowo warian-

tów polimorficznych SNps umożliwia dokonanie

dyskryminacji na poziomie sub-kontynentalym,

różnicując populacje zachodniej i wschodniej

Eurazji. Do tej pory zoptymalizowano kilka mul-

tipleksowych reakcji minisekwencjonowania,

które z powodzeniem mogą być stosowane

zarówno do celów sądowych, jak i antropo-

logicznych [11]. Spośród nich na uwagę za-

sługuje reakcja „west-Eurasia-plex”, na którą

składa się panel zawierający 16 markerów

SNp zlokalizowanych w regionie kodującym

mtDNA, definiujących 9 głównych haplogrup

zachodnio-eurazjatyckich: H, I, J, K, T, U, V,

w, X [12]. Zestaw skonstruowano wybierając

przede wszystkim mutacje znajdujące się poza

genami kodującymi białka bądź też mutacje

synonimiczne. Kierowano się tutaj postulatami

natury etycznej, według których testy stoso-

wane w genetyce sądowej powinny dotyczyć

przede wszystkim niekodujących fragmentów

genomu człowieka [2]. w zestawie „west-Eura-

sia-plex” wielkość fragmentów amplifikowanych

przed właściwą reakcją minisekwencjonowania

nie przekracza 100 p.z., co jest niewątpliwą

zaletą w przypadku zdegradowanego DNA

[12]. Konstrukcja reakcji opierała się na za-

łożeniu, iż tranzycja w pozycji 7028 różnicuje

haplogrupę H oraz pozostałe haplogrupy. Te

ostatnie definiowane są następnie na podstawie

specyficznych haplogrupowo polimorfizmów.

w celu identyfikacji haplogrup wywodzących

się z makrohaplogrupy N za pośrednictwem R,

zestaw Brandstätter i wsp. [12] wykorzystuje po-

limorfizmy C15904T dla V; g12372A i C14766T

dla U; A1811g, g12372A, C14766T i T14798C

dla K (jest to podgrupa w obrębie haplogrupy

U); A11251g, g13708A i C14766T dla J oraz

g709A, g8697A, A11251g i C14766T dla T (J i T

są haplogrupami siostrzanymi, tj. wywodzącymi

się z jednego węzła). omawiany zestaw pozwa-

la również na identyfikację haplogrupy w za

pomocą tranzycji g709A, g8251A i C14766T; X

na podstawie motywu g1719A i C14766T oraz

I poprzez tranzycje g1719A, g8251A i C14766T.

„west-Eurasia-plex” pozwala również na

oznaczanie haplogrup H1 (g3010A) oraz H3

(T6776C), najczęstszych w Europie podkladów

haplogrupy H.

Uzupełnieniem multipleksu „west-Eurasia-

-plex” jest zestaw markerów jednonukleotydo-

wych zaproponowany przez Coble i wsp. [2].

Metoda oparta na reakcji minisekwencjonowa-

nia przewiduje typowanie 59 markerów SNps,

wyselekcjonowanych na podstawie doniesień

naukowych. Są one zebrane w ośmiu multiplek-

sowych panelach i pozwalają na oznaczanie

szeregu podkladów w obrębie europejskich

haplogrup – HV, JT oraz K [2]. Niewątpliwą zaletą

systemu opracowanego przez Coble i wsp. [2]

jest zastosowanie różnych kombinacji wariantów

polimorficznych charakteryzujących haplogrupy

występujące z największą częstością w Europie,

co znacznie poprawia rozdzielczość oznaczeń.

Jednakże z uwagi na ograniczenia reakcji mul-

tipleksowych nie wszystkie SNps różnicujące

daną haplogrupę udało się zebrać w pojedyn-

czym panelu, dlatego niektóre z pozycji polimor-

ficznych umieszczone zostały w kilku różnych

multipleksach. System opracowany przez Coble

i wsp. [2] służy raczej do rozróżniania częstych

haplotypów regionu kontrolnego za pomocą

dodatkowych markerów regionu kodującego,

nie zaś do kompleksowej klasyfikacji haplogru-

powej nieznanych próbek mtDNA. Został on

więc zaprojektowany z myślą o zastosowaniach

typowo identyfikacyjnych, jako uzupełnienie ru-

tynowo stosowanych analiz sekwencji regionu

kontrolnego.

Jako że wiedza na temat markerów specy-

ficznych haplogrupowo wciąż rośnie, kolejne

zespoły badawcze opracowują systemy umoż-

liwiające coraz szybsze i dokładniejsze ozna-

czanie haplogrup na podstawie polimorfizmów

regionu kodującego. Mikkelsen i wsp. [13]

zaproponowali reakcję minisekwencjonowa-

nia, która w jednym zestawie multipleksowym

różnicuje główne haplogrupy zachodniej Eur-

azji, natomiast w drugim wyodrębnia podklady

w obrębie haplogrupy H. Rozdzielczość pierw-

szego panelu opracowanego przez cytowanych

autorów jest większa niż w przypadku zestawu

„west-Eurasia-plex”, pozwala on bowiem na

rozróżnienie szeregu podhaplogrup w obrębie

głównych kladów europejskich – U2, U4, U5,

K2a, J1b, J1c. warto jednak zwrócić uwagę, że

z wyjątkiem K2a wszystkie one są możliwe do

zidentyfikowania na podstawie diagnostycznych

polimorfizmów regionu kontrolnego. Haplo-

grupę H charakteryzuje natomiast wysoka, bo

patrycja Daca

Nr 4 215

sięgająca ok. 40-50%, częstość występowania

w populacjach europejskich oraz bardzo szeroki

zasięg geograficzny. Jednocześnie jej wewnętrz-

ne zróżnicowanie jest możliwe do zidentyfikowa-

nia poprzez sekwencjonowanie regionu kontrol-

nego tylko w niewielkim stopniu – na podstawie

SNps tego regionu można oznaczyć w sposób

niebudzący większych wątpliwości jedynie pod-

klady H1a, H6 i H15 [5]. Tymczasem w obrębie

haplogrupy H, zdefiniowanej na podstawie

tranzycji w pozycjach 2706 oraz 7028, w popu-

lacjach Europy, Bliskiego wschodu i Kaukazu

scharakteryzowano do tej pory 21 podkladów

(H1-H21), a większość z nich obejmuje szereg

drobniejszych odgałęzień [5, 14]. Drugi z paneli

opracowanych przez Mikkelsena i wsp. [13]

pozwala na identyfikację szeregu podhaplogrup

w obrębie H-H1, H1a, H1b, H2a1, H3, H3a, H5a,

H5a1, H6a1, H7, H13a1a1, H15 oraz H16.

Najbardziej szczegółowej analizy haplogrupy

H dokonali do tej pory Brandstätter i wsp. [15].

Kierując się aktualną wiedzą na temat filogenezy

tej haplogrupy wyselekcjonowali oni 45 poli-

morfizmów jednonukleotydowych, a następnie

opracowali metodę ich oznaczania za pomocą

dwóch multipleksowych zestawów pCR oraz

trzech reakcji minisekwencjonowania z wy-

korzystaniem znakowanych fluorescencyjnie

dideoksynukleotydów. Haplogrupę H oznacza-

no na podstawie wspominanych wcześniej po-

zycji SNps, a w dalszej kolejności różnicowano

na główne podgrupy występujące w Europie

(H1-H17) oraz szereg mniejszych podkladów.

Metoda ta z powodzeniem może być stosowa-

na zarówno dla celów przesiewowych, a więc

wstępnego, filogenetycznego typowania pró-

bek, jak i szczegółowej analizy poszczególnych

podgrup w obrębie haplogrupy H [15].

Analiza rozkładu częstości poszczególnych

haplogrup w obrębie populacji europejskiej

pozwala stwierdzić, iż w puli mitochondrialnego

DNA Europy pojawiają się również haplogrupy

charakterystyczne dla wschodniej Eurazji, choć

z niskimi częstościami (łącznie ok. 1.5%). przy-

kładowo, w populacji polskiej i rosyjskiej zano-

towano obecność wschodnio-euroazjatyckich

haplogrup Z1, C5c1, D5a3 czy g2a [6,16, niepub-

likowane dane autorów pracy]. Alvares-Iglesias

i wsp. [17] opracowali reakcję minisekwencjono-

wania, w której oznaczane są 32 markery SNps

z obszaru kodującego mtDNA, charakteryzujące

główne haplogrupy azjatyckie i rdzennie amery-

kańskie. Filogenetyczna klasyfikacja opiera się

w tym przypadku na zróżnicowaniu dwóch ma-

krohaplogup N i M na podstawie dwóch tranzycji

– odpowiednio w pozycjach 10398 i 10400. obie

wspomniane makrohaplogrupy mają prawie jed-

nakowy udział w całkowitej puli mtDNA w Eurazji

wschodniej. Spośród kladów wywodzących się

bezpośrednio z makrohaplogrupy N, omawiany

zestaw umożliwia oznaczanie haplogrupy A2

występującej w populacjach okołobiegunowych,

charakterystycznej dla niektórych grup Indian

amerykańskich haplogrupy X2a oraz azjatyckiej

haplogrupy N9 wraz z jej podgrupami N9a,

N9a1 oraz N9a4. w obrębie wywodzącej się z N

makrohaplogrupy R definiowanej na podstawie

tranzycji w pozycji 12705, wyróżniono dwie głów-

ne gałęzie – B oraz R9 [17]. Haplogrupa B, poza

dziewięcionukleotydową delecją w pozycjach

8281-8289, została dość szczegółowo oznaczo-

na przez włączenie wariantów SNps definiujących

jej podgrupy B4b, B4c oraz B4f. Z kolei w obrębie

R9 zestaw umożliwia oznaczenie podhaplogrup

R9b i F. wewnątrz tej ostatniej możliwe jest ozna-

czenie trzech głównych podkladów F1, F2, F3,

z czego F1 i F3 jest podzielony na mniejsze pod-

grupy. Zestaw opracowany przez cytowanych

autorów pozwala również na oznaczanie szere-

gu haplogrup wywodzących się bezpośrednio

z makrohaplogrupy M – M7, M8 (wraz z jednym

z jej dobrze znanych podkladów – C), M9, M10,

M11, M12’g oraz D. w obrębie tej ostatniej wy-

odrębniono charakteryzującą się największym

wewnętrznym zróżnicowaniem w populacjach

azjatyckich haplogrupę D4, wraz z jej rdzennie

amerykańskim podkladem D1 [17]. omówiona

reakcja jest z pewnością najpełniejszym opra-

cowanym dotychczas testem pozwalającym na

szybką identyfikację wschodnio-euroazjatyckich

i rdzennie amerykańskich haplogrup mtDNA na

podstawie wybranych wariantów SNps regionu

kodującego. Jednocześnie jednak warto zwrócić

uwagę, że odzwierciedla ona jedynie niewielką

część zróżnicowania mtDNA u mieszkańców

wschodniej Azji oraz Indian amerykańskich, po-

znanego do tej pory dzięki sekwencjonowaniu

pełnych genomów [18, 19, 20, 21]. warto rów-

nież podkreślić, że nie opracowano dotychczas

testów opartych na minisekwencjonowaniu,

które umożliwiłyby rozpoznawanie chociaż części

ogromnego zróżnicowania mtDNA w popula-

cjach afrykańskich [22].

Można się spodziewać, że w miarę dalszego

rozwoju genomiki mitochondrialnej, tj. pozna-

wania sekwencji kolejnych pełnych genomów,

będzie wzrastała także liczba testów opartych

na minisekwencjonowaniu, zwiększających roz-

dzielczość rutynowych analiz mtDNA zarówno

w genetyce populacyjnej, jak i sądowej.

ZASToSowANIE REAKCJI MINISEKwENCJoNowANIA

216 Nr 4

patrycja Daca

pIŚMIENNICTwo

Coble M. D., Real F. C., Desmyter S., Dupuy B.

M., Harrison C., Hohoff C., Just R., Krämer T.,

Morling N., Salas A., Schmitter H., Schneider p.

M., Sonntag M. L., Vallone p. M., Brandstätter

A.: Identification of west Eurasian mitochondrial

haplogroups by mtDNA SNp screening: Results

of the 2006-2007 EDNAp collaborative exercise.

Forensic Sci. Int. genetics 2008, 2, 61-68.

12. Brandstätter A., parsons T. J., parson w.:

Rapid screening of mtDNA coding region SNps

for the identification of west European Cauca-

sian haplogroups. Int. J. Legal Med. 2003, 117,

291-298.

13. Mikkelsen M . , Rockenbauer E., Sørensen

E., Børsting C., Morcing N.: A mitochondrial

DNA SNp multiplex assigning Caucasians into

36 haplo- and subhaplogroups. Forensic Sci.

Int. genetics 2008, 1, 287-289.

14. Brandstätter A., Zimmermann B., wagner

J., göbel T., Röck A., Salas A., Carracedo A.,

parson w.: Timing and deciphering mitochon-

drial DNA macro-haplogroup R0 variability in

Central Europe and Middle East. BMC Evol.

Biol. 2008, 8, 191.

15. Brandstätter A., Salas A., Niederstätter H.,

gassner C., Carracedo A., parson w.: Dissec-

tion of mitochondrial superhaplogroup H using

coding region SNps. Electrophoresis 2006, 27,

2541-2550 .

16. Malyarchuk B. A., grzybowski T., Derenko

M. V., Czarny J., woźniak M., Miścicka-Śliwka D.,

Mitochondrial DNA variability in poles and Rus-

sians, Ann. Hum. genet. 2002, 66, 261-283.

17. Alvarez-Iglesias V., Jaime J. C., Carracedo

A., Salas A.: Coding region mitochondrial DNA

SNps: Targeting East Asian and Native American

haplogroups. Forensic Sci. Int. genetics 2007,

1, 44-55.

18. Kong Q. p., Bandelt H. J., Sun C., Yao Y.

g., Salas A., Achilli A., wang C. Y., Zhong L., Zhu

C. L., wu S. F., Torroni A., Zhang Y. p.: Updating

the East Asian mtDNA phylogeny: a prerequisite

for the identification of pathogenic mutations.

Hum. Mol. genet. 2006, 15, 2076-2086.

19. Derenko M., Malyarchuk B., grzybowski

T., Denisova g., Dambueva I., perkova M., Dor-

zhu C., Luzina F., Lee H. K., Vanecek T., Villems

R., Zakharov I.: phylogeographic analysis of mi-

tochondrial DNA in northern Asian populations.

Am. J. Hum. genet. 2007, 81, 1025-1041.

20. Tamm E., Kivisild T., Reidla M., Metspalu

M., Smith D. g., Mulligan C. J., Bravi C. M.,

Rickards o., Martinez-Labarga C., Khusnutdi-

nova E. K., Fedorova S. A., golubenko M. V.,

Stepanov V. A., gubina M. A., Zhadanov S. I.,

1. parson w., Bandelt H. J.: Extended gu-

idelines for mtDNA typing of population data

in forensic science. Forensic Sci. Int.: genetics

2007, 1, 13-19.

2. Coble M. D., Just R. S., o’Callaghan J. E.,

Letmanyi I. H., peterson C. T., Irwin J. A., parsons

T. J.: Single nucleotide polymorphisms over the

entire mtDNA genome that increase the power

of forensic testing in Caucasians. Int. J. Legal

Med. 2004, 117, 137-146.

3. Vallone p. M., Just R. S., Coble M. D.,

Butler J. M., parsons T. J.: A multiplex allele-

specific primer extension assay for forensically

informative SNps distributed throughout the

mitochondrial genome. Int. J. Legal Med. 2004,

118, 147-157.

4. Sobrino B., Brión M., Carracedo A.: SNps

in forensic genetics: a review on SNp typing

methodologies. Forensic Sci. Int. 2005, 154,

181-194.

5. Roostalu U., Kutuev I., Loogväli E. L., Met-

spalu E., Tambets K., Reidla M., Khusnutdinova

E. K., Usanga E., Kivisild T., Villems R.: origin

and expansion of haplogroup H, the dominant

human mitochondrial DNA lineage in west Eu-

rasia: the Near Eastern and Caucasian perspec-

tive. Mol. Biol. Evol. 2007, 24, 436-448.

6. grzybowski T., Malyarchuk B. A., Derenko

M. V., perkova M. A., Bednarek J., woźniak M.:

Complex interactions of the Eastern and western

Slavic populations with other European groups

as revealed by mitochondrial DNA analysis. Fo-

rensic Sci. Int. genetics 2007, 1, 141-147.

7. Malyarchuk B., grzybowski T., Derenko

M., perkova M., Vanecek T., Lazur J., gomolcak

p., Tsybovsky I.: Mitochondrial DNA phylogeny

in Eastern and western Slavs. Mol. Biol. Evol.

2008, 25, 1651-1658.

8. van oven M., Kayser M.: Updated com-

prehensive phylogenetic tree of global human

mitochondrial DNA variation. Hum. Mutat. 2008,

DoI: 10.1002/humu. 20921.

9. Kwok p. Y.: Methods for genotyping single

nucleotide polymorphisms. Annu. Rev. geno-

mics Hum. genet. 2001, 2, 235-258.

10. Quintáns B., Alvarez-Iglesias V., Salas A. ,

phillips C., Lareu M. V., Carracedo Á.: Typing

of mitochondrial DNA coding region SNps of

forensic and anthropological interest using

SNapshot minisequencing. Forensic Sci. Int.

2004, 140, 251-257.

11. parson w., Fendt L., Ballard D., Børsting

C., Brinkmann B., Carracedo Á., Carvalho M.,

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: