Boom na sekwencjonowanie.pdf

Boom na sekwencjonowanie

Środa, 21 Styczeń 2009 01:40

Boom na sekwencjonowanie

Redakcja prestiżowego czasopisma Science dokonała niedawno podsumowania

minionego roku pod kątem osiągnięc naukowych. Do chlubnego grona 10 przełomów

naukowych zaliczono także gwałtowny rozwój technik sekwencjonowania DNA. Przykładowo

opublikowano pełne sekwencje genomowe pacjenta chorego na raka, Azjaty i Afrykańczyka. W

domyśle badania nad tymi genomami mają pomóc w badaniu mechanizmów odpowiednio

nowotworzenia oraz migracji ludzi na przestrzeni ostatnich kilku tysięcy lat.

Istotnego postępu dokonano także na polu genomiki roślin. W 2009 roku zostanie

opublikowany genom kukurydzy oraz znaczne fragmenty genomów soi, oraz widłaka. Może nie

brzmi to imponującą ale należy pamiętać, że badania nad genomami roślinnymi są znacznie

trudniejsze w porównaniu do ich zwierzęcych odpowiedników z uwagi na ich większy rozmiar i

ogromną ilość powtórzeń sekwencyjnych. Właśnie z powodu relatywnie małego genomu w

biologii molekularnej za modelową rośliną uznawany jest rzodkiewnik pospolity (

Arabido

psis thaliana

Do nieco bardziej egzotycznych zastosowań nowoczesnych technik sekwencjonowania

można zaliczyć badania nad genomami wymarłych gatunków. Niedawno udało się otrzymać

pełny genom mitochondrialny niedźwiedzia jaskiniowego i neandertalczyka. Zsekwecjonowano

także w przybliżeniu 70%

genomu mamuta a prace nad uzyskaniem kompletnego

genomu neandertalczyka.

1 / 4

Boom na sekwencjonowanie

Środa, 21 Styczeń 2009 01:40

Uzyskiwane w ten sposób informacje raczej na pewno nie pozwolą na „ożywienie” dinozaurów

ani innych wymarłych stworzeń ale są niezwykle cenne dla biologów ewolucyjnych. Badania

nad genomem neandertalczyka mogą pomóc w odpowiedzenie na wiele pytań dotyczących

naszego pochodzenia i ewolucji.

Metody szybkiego sekwencjonowania mają bez wątpienia znaczny potencjał aplikacyjny

i umożliwiają prowadzenie wielu interesujących badań. Dlatego warto też wiedzieć na jakiej

zasadzie działają. Obecnie istnieje kilka konkurencyjnych systemów sekwencjonowania, z

których każdy promowany jest przez inna firmę. Historycznie pierwszym była

technika

454

opracowana przez 454 Life Sciences należącą do koncernu Roche. Jej istotą jest wykorzystanie

równoległego pirosekwencjonowania wielu fragmentów DNA w tym samym czasie. Zasada

pirosekwencjonowania („sekwencjonowania poprzez syntezę”) jest stosunkowo prosta. DNA

będące matrycą dla syntezy jest unieruchamiane na podłożu stałym

a następnie w każdym kroku syntezy jest ono inkubowane wraz układem 4 enzymów:

polimerazy DNA, sulfurylazy ATP, lucyferazy oraz apyrazy. Do takiej matrycy dodaje się jeden z

czterech trifosforanów nukleozydów (dNTP). Jeżeli jest on komplementarny do nici matrycowej

to zachodzi jego inkorporacja do tworzonej przez polimerazę nici DNA. Powstały wtedy

pirofosforan reaguje z obecnym w układzie 5’ fosfosiarczanem adenozyny

dając w wyniku ATP. Reakcja ta jest katalizowana przez sulfurylazę. Powstały ATP jest

rozkładany przez lucyferazę czego efektem jest emisja światła które jest rejestrowane przez

aparaturę pomiarową. W przypadku dodania do układu reakcyjnego niewłaściwego dNTP nie

obserwuje się emisji światła a sam związek jest rozkładany przez apyrazę. W ten sposób krok

po kroku zachodzi synteza nici komlementarnej i jednocześnie zbierana jest informacja o jej

sekwencji. Podejście to pozwala w znaczący sposób przyśpieszyć cały proces przy znacznej

redukcji kosztów.

2 / 4

Boom na sekwencjonowanie

Środa, 21 Styczeń 2009 01:40

Inną techniką masowego sekwencjonowania jest technologia rozwinięta i opanowana

przez firmę Illumina . Opiera się ona na jednoczesnym sekwencjonowaniu znacznej

ilości lowowych fragmentów DNA zakotwiczonych na szklanej płytce. Naniesione fragmenty

DNA są amplifikowane tak aby ilość powtórzeń każdej matrycy wynosiła przynajmniej 1000.

Cząsteczki te są sekwencjonowane poprzez syntezę opartą na wykorzystaniu odwracalnych

terminatorów z usuwalnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Wedle zapewnień producentów

technika ta jest wierna i dobrze radzi sobie z powtórzeniami sekwencyjnymi. Ponieważ stopień

pokrycia płytki jest bardzo wysoki cały proces zachodzi bardzo szybko. Wysoka czułość detekcji

osiągana jest za pomocą wzbudzania fluoroforu laserem i stosowania specjalnie

zaprojektowanego systemu optycznego.

Najciekawszą (subiektywnym zdaniem autora) z rozwijanych technik jest opracowana

przez Pacific Biosciences technika SMRT (Single Molecule Real-Time ) Sequencing. J

ak sama nazwa wskazuje opiera się ona na wykorzystaniu pojedynczej cząsteczki polimerazy

DNA, pracującej w trybie ciągłym. Sekwencjonowanie przebiega

w małej komorze o średnicy 10 nm i objętości wynoszącej 20 zeptolitrów, utworzonej na cienkiej

metalowej warstewce nadrukowanej na kwarcową płytkę. Każdy taki chip zawiera kilka tysięcu

takich komór. Dzięki takiemu poziomowi miniaturyzacji możliwy jest pomiar aktywności

pojedynczej cząsteczki polimerazy, przytwierdzonej kowalencyjnie do ściany komory.

3 / 4

Boom na sekwencjonowanie

Środa, 21 Styczeń 2009 01:40

znajduje się przez w zasięgu detekcji o rząd wielkości dłużej niż czas potrzebny na dyfuzję

4 / 4

dołączonym do końcowego atomu fosforu. Gdy do komory reakcyjnej wprowadza się pasujący

substrat zachodzi inkorporacja nukleotydu przez cząsteczkę polimerazy przez co fluorofor

Do syntezy DNA wykorzystuje się dNTP znakowane różnymi fluorescencyjnymi ugrupowaniami

cząsteczki z komory reakcyjnej. Po włączeniu nukleotydu do łańcucha DNA zachodzi dyfuzja

znakowanego pirofosforanu i proces się powtarza. Podstawową zaletą tej techniki jest szybkość

– synteza zachodzi z szybkością 10 par zasad na sekundę. Teoretycznie możliwe jest więc (za

pomocą jednego chipu) zsekwencjonowanie ponad miliona par zasad w ciągu minuty, co

stanowi niebywały postęp w tej dziedzinie

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: