OCENA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW JAKO WSKAŹNIK USZKODZENIA NARZĄDÓW.
Enzymy są katalizatorami białkowymi reakcji chemicznych (katalizator przyspiesza reakcje chemiczną) w układach biologicznych. W żywych komórkach większości reakcji chemicznych zachodziłoby bardzo powoli, gdyby nie były katalizowane przez enzymy.
W przeciwieństwie do katalizatorów nie białkowych (H+, OH- lub jony metali) każdy enzym katalizuje niewielką liczbę reakcji, często tylko jedną. Enzymy są, więc swoistymi katalizatorami danych reakcji. Ponieważ w zasadzie wszystkie reakcje chemiczne w żywych komórkach są katalizowane przez enzymy, musi istnieć bardzo wiele różnych enzymów. Istotnie, w przyrodzie dla każdego prawie związku organicznego, a także dla wielu związków nieorganicznych, istnieje w jakimś żyjącym organizmie enzym zdolny do reagowania z nimi i katalizowania określonej reakcji chemicznej. Chociaż uważano dawniej, że aktywność katalityczna enzymów może przejawiać się jedynie w komórce nienaruszonej (stąd termin enzym, tzn. w drożdżach), to jednak można wyodrębniać z komórek większość enzymów, nie powodując utraty ich biologicznej (katalitycznej) aktywności. Tym sposobem można je badać poza żywa, komórką. Ponieważ zawartość enzymów w surowicy ludzkiej może się zmieniać w dużym stopniu w pewnych stanach chorobowych, oznaczanie stężenia enzymu w surowicy dostarcza lekarzowi ważnego środka diagnostycznego.
Swoistość enzymów.
Zdolność katalizowania tylko jednej w zasadzie swoistej reakcji jest przypuszczalnie najważniejszą właściwością enzymów. Szybkość bardzo wielu procesów metabolicznych może być, zatem regulowana precyzyjnie przez odpowiednie zmiany w katalitycznej sprawności poszczególnych enzymów. Kontrola taka, przeprowadzana przez enzym, jest istotna dla normalnego funkcjonowania komórki, tkanki i całego organizmu.
Swoistość optyczna.
Z wyjątkiem epimeraz, (racemaz), które przekształcają izomery optyczne, ogólnie enzymy wykazują absolutną swoistość optyczną, dla co najmniej części cząsteczki substratu.
Na przykład maltaza katalizuje ά -, lecz nie β – glikozydy, natomiast enzymy bezpośredniej przemiany tlenowej glukozy katalizują przekształcenia, fosforocukrów szeregu D, a nie L.
Z kilkoma wyjątkami, jak np.: oksydaza D – aminokwasów z nerki u ssaków, przytłaczająca większość enzymów działa na L – izomery aminokwasów. Inne formy życia mogą mieć enzymy o równej swoistości w stosunku do D aminokwasów.
Swoistość grupowa.
Dany enzym działa tylko na określone ugrupowania chemiczne np: glikozydazy na glikozydy, dehydrogenazy alkoholowe na alkohole, pepsyna i trypsyna na wiązania peptydowe, a esterazy na wiązania estrowe. Pomimo tych ograniczeń może być jednakże atakowana przez enzymy duża liczba substratów i w ten sposób, np.: może zmniejszać się ilość enzymów trawiennych, które byłyby potrzebne w innym przypadku. Niektóre enzymy wykazują swoistość grupową wyższego rzędu. Chymotrypsyna hydrolizuje przede wszystkim wiązania peptydowe, w których grupa karboksylowa pochodzi od aminokwasów aromatycznych: fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu. Karboksypeptydazy odszczepiają po jednym aminokwasie od końca karboksylowego, a aminopeptydazy od końca aminowego łańcucha polipeptydowego. Chociaż niektóre oksydoreduktazy działają równie dobrze z NAD, jak i z NADP jako akceptorami (biorcami) elektronów, większość z nich używa przede wszystkim jednego lub drugiego. Mówiąc ogólnie, w układach ssaków oksydoreduktazy biorące udział w procesach biosyntezy (np. synteza kwasów tłuszczowych) wykorzystują jako środek redukujący raczej zredukowany NADP, podczas gdy oksydoreduktazy działające w procesach degradacji wykorzystują głównie NAD jako środek utleniający.
Klasyfikacja i mianownictwo enzymów.
Celem klasyfikacji jest podkreślenie wzajemnych powiązań i podobieństw w sposób precyzyjny i zwięzły. Enzymy nazwano od nazwy, na który działają dodając końcówkę – aza. Tak, więc enzym rozkładający skrobię (amylum) nazwano amylazami, rozkładająca tłuszcze (lipos) – lipazami a działające na białka (proteos) – protezami. Grupy enzymów określano jako oksydazy, glikozydazy, dehydrogenazy, dekarboksylazy itd. Ostatnie badania mechanizmów reakcji organicznych i katalizowanych przez enzymy doprowadziły do utworzenia klasyfikacji bardziej racjonalnej, opierającej się na typach reakcji i ich mechanizmach. System podany przez Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB*) jest złożony, ale jest dokładny, opisowy i informacyjny. Główne zasady systemu klasyfikacji dokonanego przez Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB) są następujące:
A. Reakcja (i katalizujące je enzymy) podzielono na 6 głównych klas, a każdą z nich na 4 – 13 podklas. Sześć głównych klas wymieniono poniżej, wraz z przykładami kilku ważniejszych podklas. W nawiasach kwadratowych podano lepiej znane nazwy potoczne.
B. Nazwy enzymu składają się z 2 części. Pierwsza – zakończona na – aza, wskazuje na typ katalizowanej reakcji/druga jest nazwą substratu lub substratów. Końcówka – aza nie daje się obecnie do nazwy substratu.
C. Każdy enzym ma systematyczny numer kodu (E.C). Numer ten charakteryzuje typ reakcji, czyli klasę (pierwszy człon), podklasę (drugi człon) i pod – podklasę (trzeci człon). Czwarty człon jest kolejnym numerem 6 głównych klas enzymów z przykładami.
1. Oksydoreduktazy. Enzymy katalizujące oksydoredukcji między 2 substratami, S i S¹
S zredukowany +S utleniony S utleniony + S¹ zredukowany.
Do tej obszernej i ważnej klasy należą enzymy, które dawniej nazywano dehydrogenazami lub oksydazami. Są to enzymy katalizujące oksydoredukcje grup CH – OH, CH – CH. C = O CH – NH2 i CH = NH. Główne podklasy obejmują.
1.1. Enzymy działające na grupę CH – OH jako dawcy (donora) elektronów.
Na przykład:
1.1.1.1. Oksydoreduktaza alkohol: NAD [alkoholowa] Alkohol + NAD+ = aldehyd lub keton + NADH + H+
1.4. Enzymy działające na grupę CH – NH2 jako dawcę elektronów.
1.4.1.3. Oksydoreduktaza (dezaminująca) L – glutaminian; NAD(P) [ dehydrogenaza glutaminianowa wątroby zwierzęcej], NAD(P) oznacza, że biorcą elektronów może być zarówno NAD, jak i NADP. L – glutaminian + H2O + NAD(P)+ = ά – Ketoglutaran + NH4 + NAD(P)H + H+
1.9. Enzymy działające na grupy hemowe dawców elektronów.
1.9.3.1. Oksydoreduktaza O2: Cytochrom c [oksydazy cytochromowa].
4 zredukowane cytochromy c + O2 + 4H+ = 4 utlenione cytochromy c + 2H2O
1.11. Enzymy działające na H2O2 jako biorcy elektronów.
1.11.1.6. Oksydoreduktaza H2O2: H2O2 [kataliza]
H2O2 + H2O2 = O2+ 2H2O
2. Transferazy „ Enzymy katalizujące reakcję przenoszenia grup G (innych niż wodorów) między parą substratów S i S¹
S – G +S¹ = S¹ – G + S
W klasie tej są enzymy katalizujące reakcje przenoszenia grup jednowęglowych, reszt aldehydowych lub ketonowych oraz grup acylowych, alkilowych, glikozylowych, grup zawierających fosfor lub siarkę. Do niektórych ważniejszych podklas należą:
2.3. Acylotransferazy.
2.3.1.6. O – acetylotransferaza cholina: acetylo – CoA [cholinowa]. Acetylo – CoA + choliną CoA + O – acetylocholina
2.7. Enzymy katalizujące przenoszenie grup zawierających fosfor.
2.7.1.1. 6 – Fosfotransferaza D – heksoza: ATP [heksokinaza]
ATP + D – heksoza = ADP + D – heksozo – 6 – fosforan
3. Hydrolizy. Enzymy katalizujące hydrolizę wiązań estrowyc, eterowych, peptydowych, glikolowych, bezwodników kwasowych, C – C, C – halogenek lub N – P.
3.1. Enzymy działające na wiązania estrowe.
3.1.1.8. Acylohydrolaza acylocholiny [pseudocholineoesteraza]
Acylocholina + H2O = cholina + kwas
3.4. Enzymy działają na wiązania peptydowe.
Pozostawiono wiele nazw klasycznych (pepsyna, plazmina, renina, chymotrypsyna) ze względu na zachodzące na siebie i wątpliwe swoistości, które czynią w tym przypadku nomenklaturę systematyczną niepraktyczną.
4. Liazy.
Enzymy, które katalizują odłączenie grup od substratów w innej reakcji niż hydroliza, pozostawiają wiązania podwójne.
Należą do nich enzymy, działające na wiązania C – C, C – O, C – N, C – S, i C – halogenek. Główne podgrupy obejmują:
4.1.2. Aldehydoliazy.
4.2. Liazy węgiel – tlen. Na przykład:
4.2.1.2. Hydroliaza L – jabłczanu [hydrataza fumaranowa]
L – jabłczan = fumaran + woda
5. Izomerazy.
Klasa ta obejmuje wszystkie enzymy, katalizujące wzajemne przekształcenia izomerów optycznych, geometrycznych lub izomerów położenia. Niektóre podklasy to:
5.1. Racemazy i epimerazy.
5.1.1.1. Racemaza alaninowa
L – alanina = D – alanina
5.2. Izomerazy cis – trans.
6. Ligazy.
(ligare – wiązać). Enzymy katalizujące połączenie 2 związków sprzężone z rozerwaniem wiązania pirofosforanowego w ATP lub podobnych związków. Należą do nich enzymy katalizujące reakcje tworzenia wiązań C – O, C – S, C – N, i C – C. Reprezentują je podklasy:
6.2. Enzymy katalizującej tworzenie wiązań C – S.
6.2.1.4. Ligaza bursztynian: Co A (GDP) [synteza sukcynylo – CoA]
GDP + bursztynian + CoA = GDP + ortofosforan + sukcynylo – CoA
6.3. Enzymy katalizujące powstanie wiązań C – N.
6.3.1.2. Ligaza L – glutaminian: amoniak (ABP) [synteza glutaminowa].
ATP + L – glutaminian + NH+4 = ADP + ortofosforan + L – glutamina
6.4. Enzymy katalizujące wytwarzanie wiązań C – C.
6.4.1.2. Ligaza acetylo – CoA: CO2 (ADP) [karboksylaza acetylo – CoA].
ATP + acetylo – CoA + CO2 + H2O = ADP + ortofosforan + malonylo – CoA
Ilościowe metody oznaczania aktywności enzymów.
Niezmiernie małe ilości enzymów w wyciągach tkankowych lub płynach ustrojowych stwarzają problemy ich ilościowego oznaczania zupełnie inne niż trudności związane z oznaczaniem stężenia większości związków organicznych lub nieorganicznych. Podstawą czułej i swoistej metody oznaczania ilościowego enzymów stała się ich aktywność katalityczna. Aby zmierzyć ilość enzymów w próbce wyciągu tkankowego lub innych płynów biologicznych, mierzy się szybkość reakcji katalizowanej przez enzymy obecny w tej próbce. W odpowiednich warunkach mierzona szybkość reakcji jest proporcjonalna do ilości enzymu zawartego w próbce. Gdy tylko istnieje taka możliwość, szybkość reakcji porównuje się z szybkością reakcji katalizowanej przez znaną ilość dokładnie oczyszczonego enzymu. Pod warunkiem, że obie reakcje bada się w ściśle porównywalnych warunkach i w warunkach, w których czynnikiem ograniczającym szybkość reakcji jest stężenie enzymu (duże stężenie substratu, małe stężenie produktu, optymalne pH i temperatura), można wyliczyć mikrogramy enzymu zawartego w wyciągu.Wiele enzymów o znaczeniu klinicznym jest nieosiągalnych w stanie oczyszczonym. Tak, więc nie zawsze jest możliwe oznaczenie ilości enzymu w mikrogramach. Wyniki, zatem wyraża się w dowojuję określanych jednostkach enzymatycznych. Można wtedy porównywać względne ilości enzymu w różnych wyciągach. Jednostki enzymatyczne określą, się w mikromolach wchodząc W reakcję substratu lub powstałego produktu na minutę lub na godzinę w ściśle określonych warunkach oznaczania.
Diagnostyczny podział enzymów: sekrecyjne, ekskrecyjne i indykatorowe.
Enzymy sekrecyjne (pozakomórkowe) – wydzielane w formie aktywnej przez komórki różnych narządów, głównie wątroby i działające poza nimi, w płynach ustrojowych, w osoczu (enzymy osoczowe) np.: protrombina i inne enzymy układu krzepnięcia krwi i fibrynolizy, esteraza cholinowa, w sokach przewodu pokarmowego (amylaza, lipaza). Ich obecność we krwi jest zjawiskiem prawidłowym
Enzymy ekskrecyjne (komórkowe) – w stanach prawidłowych nie występuje w surowicy lub pojawiają się tylko w niewielkich ilościach. Są to enzymy wydzielane z gruczołów wydzielniczych ze śliną (ά – amylaza), z żółcią (fosfataza zasadowa), enzymy trzustkowe (trypsyna, chymotropsyna, ά – amylaza, lipaza, nukleinazy).
Enzymy indykatorowe (wskaźnikowe) – w stanach prawidłowych również nie występuje we krwi lub są obecne w ilościach śladowych w następstwie fizjologicznego rozpadu komórek. Jako typowe enzymy komórkowe występujące w komórkach i dopiero po ich uszkodzeniu przedostają się do otoczenia, przez co wskazują na zwiększoną przepuszczalność błony komórkowych lub zmiany martwicze poszczególnych narządów. Są to enzymy struktur komórkowych, do których zaliczają się najłatwiej przenikające do krwi enzymy cytoplazmatyczne, związane z przemianą cukrów (aldolaza, dehydrogeneza mleczanowa) lub aminokwasów (aminotransferazy), enzymy mitochondrialne związane z utlenianiem w cyklu Kresa (dehydrogenaza izocytrynianowa i jabłczanowa), cyklu kwasów tłuszczowych i łańcucha oddechowego. Do enzymów struktur komórkowych należą również enzymy lizosomalne, których wydostanie się jest szczególnie niebezpieczne, ponieważ grozi samostrawieniem tkanki. Należą do nich hydrolazy rozkładające białka (katepsyny) lub peptydy, estry (fosfataza kwaśna), glikozydazy ( Przy mniejszym uszkodzeniu przenikają tylko enzymy cytoplazmatyczne. Większe uszkodzenia prowadzą do pojawienia się enzymów struktur komórkowych.
Enzymy wskaźnikowe:
Narządowe specyficzne – dla wątroby – dehydrogenaza alkoholowa, dehydrogenaza sorbitolu, aldolaza, arginaza, dla mieśni – kineza kreatynowa.
Narządowe niespecyfIczne – enzymy cyklu Kresa (dehydrogenaza izocytrynianowa, ursztynianowa, jabłczanowa i inne),...
agasozynek