Nowoczesne i szybkie testy do badania odpowiedzi humoralnej.
q znakowanie składnika reakcji (fluorochromy, izotopy, enzymy)
q dodatkowe urządzenia – mikroskop luminescencyjny
q czytniki
Odczyn immunofluorescencyji
- fluorochromy (substancje, które pod wpływem promieni UV emitują promieniowanie w paśmie widzialnym dla oka) – najczęściej izotiocyjanian fluoresceiny
1. Bezpośredni odczyn immunofluorescencyjny:
q wykrywanie w kale lamblii,cyst
q wykrywanie wścieklizny w skrawkach mózgu
Badanie przeprowadza się na szkiełku podstawowym. Na nim badamy materiał – kał, wymazy. Utrwala się materiał, najczęściej acetonem. Następnie dodaje się przeciwciała przeciwko antygenowi, którego poszukujemy (znakowanie fluorochromem). Inkubujemy 30 min. – 1 godz. Następnie płukamy buforem, żeby wypłukać to co się nie związało. Oglądamy obraz pod mikroskopem luminescencyjnym. Obraz będzie miał kształt poszukiwanego antygenu (cysta lamblii, toxoplazma gondii).
2. Pośrednie odczyny immunofluorescencyjne:
q Toxoplazma
q FTA – ABS odczyn
Na szkiełku umieszczamy opłaszczony antygen, przeciw któremu poszukujemy przeciwciała w surowicy pacjenta. Surowicę dodajemy. Ok. 30 min. inkubujemy. Przeciwciała obecne w surowicy łączą się z antygenem. Płuczemy, żeby wypłukać niezwiązane przeciwciała. Dodajemy przeciwciała przeciw ludzkiej immunoglobulinie znakowane fluorochromem. Inkubujemy. Przeciwciała wiążą się. Następne płukanie i nie związane się wypłukują.
Giardia lamblia –świeci antygen powierzchniowy, tylko ścianka i nitki.
3. Odczyny radioimmunologiczne
q wysoka czułość
q wykrycie przeciwciał (antygenów rzędu 1 ng/ml)
q małe zastosowanie
q zasada oparta na reakcji antygenu z przeciwciałem, ale jest inna metoda odczytu – klisze i liczniki promieniowania
q izotop do znakowania
4. Odczyny immunoenzymatyczne ELISA, EIA
q Wykrycie reakcji na zasadzie enzymatycznej (znakowanie) peroksydaza chrzanowa i fosfataza zasadowa
q Substratem jest najczęściej peroksydaza ew. kwas 5-aminosalicylowy i woda utleniona, fosfataza i fosforan paranitrfenylu
Zasada odczytu – na ściankach próbówek opłaszczamy antygen, przeciwko któremu poszukujemy przeciwciał swoistych w surowicy pacjenta. Inkubacja ok. 30 min. – 1 godz. Jeśli są przeciwciała, wiążą się z antygenem na ścianie próbówki. Płukamy buforem. Dodajemy przeciwciała przeciwko ludzkiej immunoglobulinie. Znakowane enzymem. Inkubujemy.
Przeciwciała znakowane enzymem łączą się z przeciwciałami przeciw Ig.
Płukanie. Dodajemy substrat, aby uwidocznić reakcję. Reakcja barwna – intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do zawartości przeciwciał.
Czytniki – spektrofotometr.
Zastosowanie – zakażenie wirusowe, bakteryjne, pierwotniakowe.
5. Metoda Western – blot
q Rozdział białek metodą elektroforetyczną na żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylu
q Transfer na nitrocelulozę
Pasek nitrocelulozy z rozdzielonymi białkami. Inkubacja, płukanie. Dodajemy przeciwciałą przeciwko ludzkiej immunoglobulinie znakowanej enzymem – peroksydazą. Substrat – aminobenzydyna. Barwne prążki na pasku nitrocelulozowym, gdy są przeciwciała.
Metoda potwierdzająca, referencyjna dla wirusa HIV, w chorobie z LYME, w kile.
Dr.Rockit