Chromatografia - Urzadzenia i aparatura.pdf - CHROMATOGRAFIA - namida

3. Urządzenia i aparatura stosowane w chromatografii cieczowej

Najważniejszym elementem chromatografii cieczowej, bez ktrego rozdział chromato-

graficzny nie może być wykonany, jest kolumna chromatograficzna. Jest to cylindryczny

pojemnik z jednym wejściem i jednym wyjściem, wypełniony porowatą substancją (złożem,

żelem). Wypełnienie kolumny dobrane jest w ten sposb by spełnić wymagania stawiane

wybranej technice chromatograficznej. Poszczeglne rodzaje złż oraz ich charakterystyki

omwione są w następnych rozdziałach tego opracowania. Pozostałe urządzenia powszechnie

stosowane w chromatografii cieczowej, jakkolwiek niezmiernie ważne, nie są niezbędne dla

przeprowadzenia procesu separacji makromolekuł. Przepływ solwentu przez kolumnę

możliwy jest tylko wtedy, gdy pomiędzy wejściem i wyjściem kolumny panuje rżnica

ciśnień. Tę rżnicę ciśnień, w postaci ciśnienia hydrostatycznego, wywołuje wszechobecne

pole grawitacyjne, jeżeli tylko grna powierzchnia solwentu położona jest powyżej wypływu

z kolumny. Niestety, tak uzyskana rżnica ciśnień nie zawsze jest wystarczająca do

wymuszenia odpowiedniego przepływu. W związku z tym stosuje się specjalne pompy

chromatograficzne, wymuszające znacznie większe przepływy, dzięki wyższym ciśnieniom do

jakich mechanicznie sprężany jest solwent. Aby mgł zaistnieć przepływ solwentu z pompy

do kolumny, niezbędne są odpowiednie wężyki zwane inaczej drenami lub kapilarami.

Wężyki te dostarczają solwent (lub solwenty) ze zbiornikw Î poprzez pompę, mikser i

zawr iniekcyjny Î do kolumny, a stamtąd do detektora przepływowego i dalej do kolektora

frakcji. Elektryczny sygnał z detektora przekazywany jest do rejestratora (integratora), gdzie

podlega zapisowi i analizie. Schemat podstawowego systemu chromatografii cieczowej

przedstawiony jest na rysunku 3.1.

Systemy chromatografii można podzielić na trzy grupy. Do pierwszej grupy zalicza się

systemy niskociśnieniowe, w ktrych maksymalne ciśnienie solwentu nie przekracza 0,5 MPa.

W ramach tej grupy przepływ solwentw wymuszany jest dzięki stosowaniu pomp

perystaltycznych lub dzięki grawitacyjnej rżnicy ciśnień, wytworzonych rżną wysokością

słupa cieczy (solwentu). Do drugiej grupy zwyczajowo zalicza się systemy

wysokociśnieniowe ( h igh p erformance l iquid c hromatography Î HPLC, f ast p rotein

l iquid c hromatography Î FPLC ), w ktrych pompy mogą wytwarzać ciśnienia powyżej 0,5

MPa. Grna granica ciśnienia nie jest określana, ale większość systemw HPLC może

wytwarzać ciśnienia powyżej 10 MPa. Trzecią grupę stanowią systemy chromatografii

przemysłowej.

Rys. 3.1.

Schemat systemu chromatografii cieczowej. Przepływ cieczy (solwentw) z naczyń A i B wymuszany jest przez

pompę P . Skład solwentu kontrolowany jest przez zawr Z , dzięki ktremu możliwe jest tworzenie gradientu

stężenia cieczy B w A . Z pompy ciecz podawana jest do miksera M , gdzie jest poddawana dokładnemu

wymieszaniu. W następnej kolejności solwent podawany jest do zaworu iniekcyjnego ZI . Zawr ten ma zwykle

kilka portw, co umożliwia wybr drogi przepływu solwentu. Solwent może być skierowany bezpośrednio na

kolumnę, z pominięciem pętli L . Jeżeli prbka do rozdziału wcześniej naniesiona jest do pętli L (przy pomocy

strzykawki S ) to przeprowadzenie solwentu przez tę pętlę powoduje naniesienie prbki na kolumnę K . Naczynie

W gromadzi solwent wypchnięty z pętli L w trakcie jej wypełniania prbką oraz solwent użyty do przemycia

systemu. Rozdzielone składniki prbki wraz z solwentem wypływają z kolumny i dostają się do detektora UV i

ewentualnie do detektora pH -metrycznego i/lub konduktometrycznego. Zmiany właściwości fizycznych

wypływającego z kolumny materiału są rejestrowane przez detektor (detektory). Informacja o tym przekazywana

jest do rejestratora-integratora INT , a rozdzielony na kolumnie materiał zbierany jest przez kolektor frakcji

FRA . Całość systemu jest sterowana z poziomu kontrolera chromatografii KON . Do systemu takiego można

podłączyć automatyczny podajnik prbek (autosampler), co pozwala zautomatyzować cykl rozdziałw.

3.1. Urządzenia i aparatura w chromatografii niskociśnieniowej

Poniżej zwięźle scharakteryzowane są rżne akcesoria potrzebne do zestawienia

niskociśnieniowego, manualnego systemu chromatografii cieczowej. W następnej kolejności

omwiony zostanie system automatyczny, zawierający w przeważającej większości w swym

składzie omwione wcześniej elementy.

3.1.1. Kolumny

W zależności od potrzeb i przeznaczenia stosowane są kolumny o rżnych rozmiarach

i rżnym typie budowy. Kolumny te przeznaczone są do samodzielnego ich wypełniania

wybranymi złożami. Aby uprościć proces upakowywania złoża w kolumnie, stosuje się

specjalne naczynia mocowane na grnej części kolumny ( ang. packing reservoirs ), ktre

ułatwiają uzyskanie jednorodnej struktury złoża. Wysokość złoża w kolumnie może być

regulowana przy pomocy adaptorw, ktre wypełniają sobą część kolumny wolną od złoża

i pozwalają do minimum ograniczyć objętość martwą kolumny. Kolumny mogą być osłonięte

dodatkowym pojemnikiem ( ang. thermostatic jacket ) umożliwiającym termostatowanie złoża

przy pomocy opływającego kolumnę płaszcza wodnego.

Rys. 3.2.

Schemat kolumny chromatograficznej XK . Podstawowym elementem

składowym kolumny jest szklana lub plastikowa rura R , na końcach ktrej

zamocowane są końcwki K wyposażone w specjalnej konstrukcji sita S

utrzymujące wypełnienie w kolumnie. Do końcwek kolumny mocowane są

wężyki W doprowadzające i odprowadzające solwent. Kolumna może być

wyposażona w adaptor A oraz płaszcz termostatujący T.

W tabeli 3.1. zebrane są najważniejsze informacje dotyczące

pustych kolumn. Przy wyborze kolumny należy kierować się

głwnie jej rozmiarami oraz wytrzymałością mechaniczną. Do

filtracji żelowej potrzeba kolumn o możliwie największej

długości. Wyboru średnicy kolumny należy wtedy dokonać na drodze kompromisu między

ilością potrzebnego złoża oraz objętością prbki, jaką planujemy nanieść na kolumnę. W

technikach adsorpcyjnych długość kolumny nie wpływa znacząco na jej selektywność, ale im

krtsza kolumna tym niższym ciśnieniem można wymusić określony przepływ. W tym

przypadku należy rozpocząć wybr raczej od zdefiniowania objętości złoża i do tej objętości

dobrać kolumnę o maksymalnie dużej średnicy. Niewykorzystaną część objętości kolumny

można wtedy zredukować stosując adaptor(y).

Tabela 3.1.

Zestawienie podstawowych informacji o pustych kolumnach chromatograficznych. Dane zaczerpnięte

z aktualnego (2000 r.) katalogu firmy Amersham Pharmacia Biotech.

Typ

kolumny

Rodzaj materiału

Ekstremalne

długości (cm)

Ekstremalne

średnice (mm)

Maksymalne

ciśnienie

(MPa)

Adaptor

i naczynie do

pakowania

Termostatowanie

Szkło

borokrzemowe

10 - 100

10 - 26

0,1

tak, tak

nie

Szkło

borokrzemowe

15 - 100

9 Î 50

0,1 Î 0,5

tak, tak

tak

Szkło

borokrzemowe

45 - 100

10 - 25

0,3 Î 1,0

tak, tak

tak

Szkło

borokrzemowe

2,0 - 50

5 Î 16

3,0 Î 10,0

tak, tak

nie

PD-10

Polipropylen

przepływ

grawitacyjny

nie, nie

nie

3.1.2. Pompy

Przepływ solwentw w zakresie niskich ciśnień można skutecznie wymusić stosując

pompy perystaltyczne. Konstrukcja pomp pozwala regulować prędkość przepływu solwentw

w dość dużym zakresie, przy zadowalającej stabilności tego przepływu. Zasadniczą wadą

pomp perystaltycznych jest pulsacja ciśnienia, bardzo niekorzystnie wpływająca na złoża oraz

na jakość rozdziałw. Bardziej zaawansowane technologicznie pompy tłokowe, na przykład

pompa P-50 , pozwalają wyeliminować tę wadę.

Rys. 3.3.

Pompy chromatograficzne stosowane w zakresie

niskich ciśnień. P-1 jest pompą perystaltyczną

z wymiennymi wężykami o rżnych przekrojach

wewnętrznych i rżnej odporności chemicznej. P-50

jest prostą pompą tłokową pozwalającą znacznie

ograniczyć pulsację tłoczonych solwentw.

Tabela 3.2.

Pompy stosowane do wymuszania przepływu w zakresie niskich ciśnień. Dane zaczerpnięte z aktualnego (2000

r.) katalogu firmy Amersham Pharmacia Biotech.

Typ pompy

Przepływ max/min

(ml/min)

Ciśnienie max

(MPa)

Kompensacja pulsacji

P-1

0,01 Î 8,0

0,2

nie

P-50

0,1 Î 49,9

0,5

tak

3.1.3. Detektory

W chromatografii biomolekuł najczęściej stosowane są detektory rejestrujące zmiany

gęstości optycznej przepływającej substancji mierzone dla wybranej długości fali. Dla detekcji

białek i peptydw powszechnie stosuje się światło o długości fali 280 nm. Światło o tej

długości fali jest pochłaniane przez aminokwasy aromatyczne. Mniej chętnie stosuje się falę o

długości 230 nm, pochłanianą przez wiązania peptydowe. Powodem tego jest fakt, że tak

krtkie fale są silnie i nierezonansowo pochłaniane przez rżne substancje, co znacznie

komplikuje proces detekcji. Nukleotydy i kwasy nukleinowe pochłaniają światło o długości

fali 254 nm, ale wiele detektorw pracuje skutecznie przy długości fali 260 nm.

Rys. 3.4.

Najczęściej stosowany w chromatografii nisko-

ciśnieniowej detektor UV-1 . Detektor ten może

być wyposażony w filtry: 254, 280 i 405 nm.

Jako detektor w pełnym zakresie spektralnym

(190-1100 nm) może być zastosowany

spektrofotometr Ultrospec 2000 z zamontowaną

kuwetką przepływową. Instrument ten może

dokonywać jednoczesnego pomiaru w kilku

długościach fali.

Większość detektorw UV, przeznaczonych do prac w zakresie niskich ciśnień,

wyposażona jest w monochromatyczne filtry, co umożliwia pomiar tylko dla wybranych

długości fali. Detektory te mogą być wyposażone w celki rżniące się długością drogi

optycznej, co powoduje rżną ich objętość. Uwagę zwraca tutaj możliwość zastosowania

spektrofotometru Ultrospec 2000 jako detektora UV. Zaletą tego wyboru jest możliwość

płynnego wyboru długości fali jak i możliwość jednoczesnego pomiaru w wielu długościach

Chromatografia - Urzadzenia i aparatura.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: