Fluorescencja.pdf

PODSTAWY METOD FLUORESCENCYJNYCH

Fluorescencja jest rodzajem luminescencji, czyli zjawiska polegającego na emitowaniu przez

niektóre substancje światła, wywołane naświetleniem z zewnątrz czyli pochłonięciem kwantu

promieniowania elektromagnetycznego. Czas trwania fluorescencji jest krótki i w praktyce

ustaje z przerwaniem dostarczania promieniowania wzbudzającego. Długość fali emitowanej

zawsze jest większa niż długość fali wzbudzającej.

Barwniki fluorescencyjne

Barwniki fluorescencyjne są używane do znakowania struktur komórkowych poprzez

wiązanie z nimi w utrwalonych i żywych komórkach. Są to barwniki selektywnie

absorbujące i emitujące światło o określonej długości fali. Kolor fluorescencji zależy od

własności substancji fluoryzującej. W zależności od długości fali emisji barwniki można

podzielić na emitujące światło:

zielone – fluoresceina i jej pochodne (wzbudzana światłem niebieskim)

czerwone- rodamina (wzbudzana światłem zielono-żółtym)

niebieskie- DAPI (wzbudzany światłem ultrafioletowym)

Przykłady barwników fluorescencyjnych

DIOC – dla siateczki endoplazmatycznej – jest lipofilowym węglowocyjankowym

barwnikiem barwiącym struktury błonowe w komórkach żywych jak i utrwalonych w

formaldehydzie i glutaraldehydzie. Absorpcja ok. 483 nm (niebieski) i emisja ok. 600 nm.

Oranż akrydynowy (AO) – Tani, ale mało specyficzny barwnik różnych struktur

komórkowych, w tym DNA i RNA. Zielona fluorescencja dla DNA (chromatyna), czerwona

dla RNA (jąderko). Oranż akrydyny może być stosowany do nieutrwalonych, żywych

komórek, a także do różnicowania komórek żywych i martwych. Intensywność zabarwienia

zależy od koncentracji barwnika. Absorpcja: 440 – 480 nm, emisja: 520 (zieleń dla DNA) ,

650 nm (czerwień dla RNA).

Barwniki specyficzne dla kwasów nukleinowych (DNA, RNA):

DAPI – DAPI (4-6-diaminoino-2-fenylindol) tworzy fluorescencyjne kompleksy z

sekwencjami bogatymi w pary AT w podwójnym łańcuchu DNA. Szeroko stosowany,

stabilny barwnik dla DNA, zwłaszcza dla utrwalonych komórek. DAPI jest wzbudzany

światłem ultrafioletowym a emituje światło niebieskie. Maksimum absorpcji 344 nm, emisja

449 nm. Ponieważ DAPI przenika przez nienaruszone błony biologiczne, może być używany

do wybarwiania zarówno komórek martwych jak i żywych.

Hoechst - rodzina barwników fluorescencyjnych wybarwiających DNA. Najpopularniejsze z

rodziny są barwniki Hoechst 33258 oraz Hoechst 33342 . Barwniki te (33258 i 33342) są

wzbudzane światłem ultrafioletowym przy długości fali 345 nm. Maksimum emisji wypada

przy ok. 485 nm (kolor niebiesko-fioletowy). Ponieważ Hoechst przenika przez nienaruszone

błony biologiczne może być używany do wybarwiania zarówno utrwalonych komórek jak i

żywych i często bywa używany jako substytut DAPI. Różnica pomiędzy nimi wynika z tego,

że Hoechst 33342, wyposażony w dodatkową grupę etylową, jest bardziej lipofilowy, w

związku z czym lepiej przenika przez błony biologiczne. Barwniki Hoechst nadają się także

do ilościowego oznaczania DNA w próbie, gdyż siła ich sygnału jest wprost proporcjonalna

do ilości DNA .

Jodek propidyny PI- barwnik dla DNA i RNA Jodek propidyny nie jest transportowany do

komórki jeśli posiada ona funkcjonalną błonę cytoplazmatyczną. Za pomocą PI barwione są na

czerwono komórki z uszkodzoną błoną (martwe – nekrotyczne lub znajdujące się w późnych

fazach apoptozy). Jodek propidyny można obserwować po wzbudzeniu światłem niebieskim (max

488 nm), emituje światło czerwone w zakresie >620 nm.

Bromek etydyny - Pod wpływem promieniowania UV fluoryzuje w kolorze różowo-

pomarańczowym. Intensywność fluorescencji wzrasta ok. 20 razy po przyłączeniu do DNA

pozwalając tym samym na obrazowanie prążków DNA w żelu. Dlatego jest często używany

w technikach takich, jak elektroforeza żelowa DNA. Bromek etydyny wykazuje również

powinowactwo do RNA, jest ono jednak dużo słabsze.

Barwniki specyficzne dla mitochondriów:

MitoTrack er – rodzina barwników fluorescencyjnych wybarwiających mitochondria.

MitoTracker Green (absorpcja: 490 nm, emisja: 516 nm), MitoTracker Orange (absorbcja:

551 nm, emisja: 576), Mitotracker Red (absorbcja: 578 nm, emisja: 599 nm).

Rodamina 123 – kationowy barwnik akumulowany w ujemnie naładowanych

kompartymentach komórkowych. Duża powierzchnia błon wpuklonych do matriks

mitochondrium prawdopodobnie odpowiada za wiązanie znacznych ilości barwnika.

Rodamina 123 umożliwia śledzenie zmian w budowie mitochondriów podczas działania na

komórki np. kolchicyną. Absorbcja: 485 nm, emisja: 530 nm.

N iektóre substancje mają zdolność do własnej fluorescencji pod wpływem promieni

ultrafioletowych lub niebiesko-fioletowych. Emitują światło od barwy niebieskiej do

czerwonej (w zakresie światła widzialnego). Zjawisko to nosi nazwę autofluorescencji.

Przykłady:

Chlorofil (chloroplasty) po wzbudzeniu falą o długości 360-370 nm (filtr dla DAPI) lub

460-490 nm (filtr dla fluoresceiny) – emisja światła czerwonego.

Celuloza (ściany komórek roślinnych ) po wzbudzeniu falą o długości 360-370 nm (filtr dla

DAPI)- emisja światła niebieskiego.

Lipofuscyny, porfiryny, witamina A.

Substancje przeciwdziałające zanikowi fluorescencji - czas trwania fluorescencji jest

zwykle bardzo krótki i ustaje po kilku sekundach, pomimo dostarczania promieniowania

wzbudzającego. Dlatego stosuje się substancje przedłużające czas trwania fluorescencji (tzw.

anty-bleaching medium , anty-fade medium ). Taką powszechnie używaną substancją jest

n-propylgallate .

Mikroskop fluorescencyjny

Do obserwacji fluorescencji potrzebny jest specjalny mikroskop fluorescencyjny. Jest to

mikroskop optyczny, w którym źródłem światła jest specjalna żarówka (żarnik rtęciowy lub

lampa ksenonowa) emitująca promieniowanie UV. Niezbędnym elementem wyposażenia

takiego mikroskopu jest zestaw filtrów:

Filtr wzbudzenia - przepuszcza światło o pożądanej długości fali odpowiadającej wzbudzeniu

fluorescencji w badanym preparacie.

Filtr barierowy (odcinający)- przepuszcza jedynie widzialną część widma odpowiadającą

emisji substancji fluoryzującej, pochłania ultrafiolet chroniąc wzrok obserwatora przed

szkodliwym działaniem promieni UV.

PRAKTYKA

Wykrywanie autofluorescencji (chlorofil i celuloza).

Wykonanie preparatu mikroskopowego z glonów i oglądanie w mikroskopie

fluorescencyjnym przy filtrach wzbudzających dla DAPI i dla fluoresceiny. Emisja trwa

długo wobec czego nie ma konieczności używania substancji przeciwdziałających zanikowi

fluorescencji.

Barwienie DAPI

Materiał: nabłonek jamy ustnej, sperma myszy. Do materiału dodaje się PBS (roztwór soli

fizjologicznej w buforze fosforanowym)

1. Zrobić rozmaz na szkiełku podstawowym i lekko wysuszyć

2. Zalać PBS z 0.1% TRITON X-100 na 10 min w temp.0-4 o C w celu permabilizacji

błon komórkowych.

3. Zalać roztworem PBS z 4% paraformaldehydem (lub 4% formaliną) zawierającym

10 g/ml DAPI na 5 min. Paraformaldehyd i formalina delikatnie utrwalają materiał.

4. Zlać PBS+PFA+DAPI, przepłukać PBS, nakropić roztwór n-propylgallate w

glicerynie (anty-bleaching medium), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i oglądać

przy filtrze dla DAPI 360-370 nm.

Wyniki: DNA w jądrach (chromatyna) i DNA bakterii – niebieskie.

Barwienie oranżem akrydyny :

Materiał: komórki nabłonka jamy ustnej.

1. Pobrać komórki i wymieszać z PBS.

2. Sporządzić rozmaz na szkiełku podstawowym i delikatnie podsuszyć.

3. Dodać 5 l wodnego r-ru oranżu akrydyny (roztwór prawie bezbarwny).

4. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i oglądać używając filtru dla fluoresceiny 460-

490 nm. Można nałożyć kropelkę n-propylgallate w glicerynie i dopiero przykryć

szkiełkiem.

Wyniki: komórki żywe-żółtozielone, martwe-czerwone

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: