Paulina Krzemińska 14.12.2011r.
Opis doświadczenia 7:Lecytyny i cholesterol z żółtka jaja kurzego – izolacja i wykrywanie.
Etapy procesu izolacji:
1. Oddzieliłam żółtko od białka, a następnie zalałam żółtko mieszaniną etanol-eter dietylowy. Etanol spowodował denaturację pozostałości białka, natomiast w eterze rozpuściły się lipidy.
2. Odsączyłam zawiesinę na sączku karbowanym do kolby kulistej, po to aby pozbyć się zdenaturowanego białka i aby oczyścić roztwór lecytyn, kefalin i cholesterolu. Odparowałam eter dietylowy – część zatężonego roztworu zachowałam do analizy chromatograficznej (2).
3. Wkropliłam zatężony roztwór do zlewki z acetonem w celu wydobycia lecytyn i kefalin. Następnie osad lecytyn i kefalin odsączyłam na sączku karbowanym i część osadu zachowałam do analizy na płytce TLC (X); zachowałam także część przesączu do analizy TLC.
4. Pozostałą część osadu rozpuszczam w etanolu, po czym dodaję etanolowego roztworu chlorku kadmu, aby oddzielić kefaliny i lecytyny – lecytyna tworzy krystaliczny kompleks z CdCl2(3).
5. Odsączyłam kompleks lecytyn na sączku karbowanym do kolby kulistej, a następnie odparowałam rozpuszczalnik i pobrałam część osadu kompleksu lecytyny z CdCl2 do analizy chromatograficznej.
Chromatografia cienkowarstwowa TLC:
Następujące próbki nanoszę na szklane płytki pokryte żelem krzemionkowym:
W – wzorzec cholesterolu w chloroformie;
2 – wydzielone lecytyny, kefaliny i cholesterol;
X – surowy osad lecytyn i kefalin;
3 – kompleks lecytyn z CdCl2;
4 – pozostałość po wydzieleniu lecytyn.
Każdą z płytek rozwijam w dwóch układach:
- chloroform-MeOH-woda 65:25:4
- toluen-octan etylu 7:3
Następnie wywołuję płytki w następujący sposób:
1) spryskanie 0,1% roztworem ninhydryny w etanolu i wysuszeniu w piecu w 120 oC.
Spryskanie ninhydryną służy wykryciu wolnych grup aminowych.
2) umieszczenie płytki w komorze z jodem.
W ten sposób wykrywa się wiązania podwójne nienasyconych kwasów tłuszczowych. Plamki mają brunatny kolor na żółtym tle.
3) spryskanie 5% roztworem kwasu siarkowego i wysuszeniu w piecu w 120 oC.
Kwas siarkowy barwi cholesterol na kolor ciemnoczerwony.
Wyniki chromatografii:
CHCl3-MeOH-H2O
Toluen-CH3CO2Et
ninhydryna
- brak plamki dla wzorca cholesterolu (brak wolnej grupy a-aminowej)
- pozostałe plamki 2, X, 3 oraz 4 ruszyły dość znacznie ze startu – układ jest dość polarny, więc powoduje migrację polarnych związków, którymi są lecytyny i kefaliny; wartości Rf:
Rf,2=2,8/6=0,47
Rf,X=2,8/6=0,47
Rf,3=2,7/6=0,45
Rf,4=3/6=0,5
oraz druga grupa plamek:
Rf,2=1/6=0,17
Rf,X=1,2/6=0,2
Rf,3=1,2/6=0,2
Rf,4=1/6=0,17
Wniosek: W próbkach 2,X,3 i 4 występuje wolna grupa aminowa. Jednak nie powinniśmy obserwować plamki w przypadku próbki nr 3 ponieważ powinna ona zawierać lecytynę, w której występuje cholina – czwartorzędowa sól amoniowa. Próbka musiała więc być zabrudzona kefalinami.
- plamki barwy fioletowej występują we wszystkich próbkach, dla numerów 3 oraz 4 są jednak dość blade
- plamki nie ruszyły ze startu ze względu na zbyt słaby układ.
Ponadto wiadomo, iż nie powinniśmy obserwować plamki dla próbki nr 3.
pary jodu
- Pojawiło się dość dużo plamek, które świadczą o występowaniu różnych związków z wiązaniami podwójnymi
- Cholesterol, zawierający jedno wiązanie podwójne znajdował się w próbkach nr 2 i 4. Świadczą o tym plamki o zbliżonej wartości Rf:
Rf,W=4,8/6,2=0,77
Rf,2=5/6=0,83
Rf,4=5/6=0,83
Powinien on się jednak znajdować również w próbce nr X, jednak plamka nie pojawiła się lub była zbyt blada, aby ją zauważyć.
- W próbkach 2, X, 3 i 4 pokazały się dwie grupy plamek:
Rf,2=1,5/6,2=0,24
Rf,X=1,5/6,2=0,24
Rf,3=1,4/6,2=0,23
Rf,4=1,5/6,2=0,24
oraz
Rf,2=3/6,2=0,48
Rf,X=3/6,2=0,48
Rf,3=2,8/6,2=0,45
Rf,4=2,9/6,2=0,47
co świadczy o występowaniu dwóch grup nienasyconych kwasów tłuszczowych, o podobnym charakterze.
- W mniej polarnym układzie ze startu ruszyły jedynie plamki wzorca cholesterolu Rf,W=2,5/6,2=0,4 oraz z próbki nr 2 Rf,2=2,2/6,2=0,35, co świadczy o tym iż zawierała ona cholesterol. W tym przypadku również nie obserwujemy plamek dla próbeki X oraz dla próbki 4, chociaż powinny one zawierać cholesterol. Wydaje się jednak, że plamki mogły się pojawić, jednak były zbyt mało intensywne.
- W przypadku próbek X, 3, 4 oraz również 2 na starcie zostały barwne plamki: brak zmiany pozycji plamek świadczy o użyciu zbyt mało polarnego układu. Jednak dzięki zabarwieniu wiemy, iż we wszystkich próbkach znajdują się związki z wiązaniem podwójnym.
kwas siarkowy
- Dla wszystkich próbek obserwujemy plamki. Mają one jednak różną intensywność, przy obliczaniu współczynników Rf posłużę się tymi o największej intensywności barwy (ciemnoczerwone), ponieważ zakładam iż powinny mieć one barwę zbliżoną do wzorca.
Rf,W=4,5/5,6=0,8
Próbki 2, X oraz 4 również zawierają cholesterol, o czym świadczy zbliżona wartość współczynnika Rf:
Rf,2=4,8/5,6=0,86
Rf,X=4,8/5,6=0,86
Rf,4=4,8/5,6=0,86
W próbce nr 3 nie obserwujemy plamki pochodzącej od cholesterolu, ponieważ jest to kompleks lecytyn z CdCl2 i jak widać nie jest zabrudzony cholesterolem.
- Podobnie jak dla bardziej polarnego układu plamki obserwujemy jedynie w przypadku wzorca oraz próbek nr 2, X i 4. Wartości Rf wynoszą:
Rf,W=3,3/8=0,41
Rf,2=3,5/8=0,44
Rf,X=3,4/8=0,43
Rf,4=3,4/8=0,43
Próbka nr 3 nie zawiera cholesterolu.
pu_lina