OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PSII.
Wstęp:
PSII-inaczej fotosystem II.Jest to jeden z dwóch kompleksów barwnikowo-białkowych aparatu fotosyntetycznego. PSII działa z maksymalną wydajnością przy długości fali 680 nm. Fotoukład PSII występuje głównie w tylakoidach gran. Charakterystyczne dla fotoukładu II są układy antenowego określane nazwą – LHC II, w których stosunek chlorofilu a do chlorofilu b wynosi: a:b = 1:1. PSII katalizuje indukowane światłem przeniesienie elektronów z utlenionej cząsteczki wody (donora) na pulę plastochinonu rozpuszczalnego w dwuwarstwie lipidowej chinonu. Aktywnośc PSII można zdefiniowac jako ilośc elektronów przeniesionych z wody na plastochinon w jednostce czasu , przeliczoną na jednostkę masy chlorofilu w próbce.
Wykonanie:
· Przed przystąpieniem do oznaczania aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę, wykonano izolację błon tylakoidów z liści sałaty zgodnie z instrukcją zawartą w rozdziale 9.1 (,,Praktikum z biochemii” pod zbiorową redakcją Amalii Guzdek i Pawła Maka).
· Po wyizolowaniu błon tylakoidów przystąpiono do oznaczenia zawartości chlorofilu w zawiesinie:
· Po dokładnym wymieszaniu zawiesiny tylakoidów uzyskanej wcześniej, odpipetowano po 400 mikrolitrów tej zawiesiny do przygotowanych wcześniej 2 probówek typu Eppendorf.
· Do każdej dodano po 1600 mikrolitrów acetonu
· Odwirowano je przez 5 minut(10000 obr./min.), a następnie zmierzono absorbancję wzgledem 80% acetonu przy 3 długościach fali: 645, 663, 710 ( poziom tła).
· Wyniki zestawiono W tabeli numer 1.
Tabela nr.1
Długośc fali
Wynik pomiaru absorbancji
645
0,462
663
1,114
710
-0,013
Następnie obliczono stężenie chlorofilu a i b.
Stężenie chlorofilu a i b:
CChl (a+b) = 20,2 (A645-A710) + 8,02(A663-A710)
CChl (a+b) = 20,2 * (0,462+0,013) + 8,02 *(1,114+0,013)=18,63354 μg/ml masy
Przystąpiono do oznaczania aktywności PSII.
· Przygotowaną wcześniej zawiesinę błon tylakoidów, rozcieńczono buforem 10 mM Tricyna-NaOH pH 7,7 z dodatkiem 1mM MgCl.2
· Próbkę przygotowano i przechowywano w lodzie, bez wystawiania na działanie światla.
18,63 µg ---1ml
x --- 3ml x=59,76 µg - to jest ilośc chlorofilu a i b, znajdującgo się w 500 µl roztworu-uzyskaliśmy go po pobraniu połowy roztworu powstałego po połączeniu 200µl zawiesiny i 800 µl acetonuà stąd wynika,że w 500 µl roztworu jest 100µl zawiesiny chloroplastów.
Więc ostateczne stężenie:
59,76 µg---100 µl
x --- 1000 µl x= 597,6 µg-à stężenie= 597,6 µg/ ml
Zgodnie z założeniem, że stężenie chlorofilu w próbce ma się zawierac w granicy 20-40 µg/ml, obliczono:
40 µg---1ml
x ---10ml x=400 µg
597,6 µg ---1ml
400 µg ---x x=0,669-tyle pobrano roztworu i uzupełniono 9,33 ml buforu
Ponieważ po pobraniu 1,9 roztworu, stęzenie było zbyt duże więc do 8,1 dodano 3 ml buforu:
x ---8,1 ml x=324-masa chlorofilu
- następnie pobrano 1,5 ml roztworu i wymieszano z 1,5 ml buforu:
324---11,1
x---1,5 x=43,78-w 3ml roztworuà w 1ml roztworu-14,5 µg
- z tego pobrano 1,92 mlà 14,5—1ml, więc w 1,92 mamy 27,84 µg chlorofilu w ml uzyskanego roztworu.
· Do kuwety spektrofotometrycznej odmierzono 0,5 ml zawiesiny i 1,5 ml buforu E i 100 mikrolitrów DCIP.
· Próbkę umieszczono w spektrofotometrze i dokonano pomiaru absorbancji przy długości fali=590 nm.
· Po pierwszym pomiarze próbkę wyciągnięto ze spektrofotometru , oświetlono ją wysycającym światłem białym przez czas=30 sekund, ponownie dokonano pomiaru absorbancji.
· Wykonano 3 pomiar absorbancji przy wcześniejszym podaniu do kuwety DCIP. Zmierzono absorbancję bezpośrednio po wymieszaniu składników, oraz po naświetleniu próbki przez 30 sekund – próba III- hamowanie aktywności PSII przez DCMU
· Wszystkie wyniki zestawiono w tabeli numer 2.
Tabela nr.2
A
B
C
D
T [s]
λ=590nm
Zawiesina z DCMU
λ =590nm + DCIP
1900ul zawiesiny + 100ul DCIP
+DCMU
1850ul zawiesiny + 50ul DCMU + 100ul DCIP
0
0,473
0,431
0,441
0,456
30
0,266
0,423
0,237
0,448
60
0,082
------
0,052
Na podstawie wyników tabeli sporządzono wykresy zależności A(absorbancji) od T (czasu).
Wykres numer 1-zależnośc absorbancji od czasu dla próby A.
Wykres numer 2- zależnośc absorbancji od czasu dla próby B.
Wykres numer 3-zależnośc absorbancji od czasu dla próby 3.
Wykres numer 4-zależnośc absorbancji od czasu dla próby D.
Obliczono aktywnośc PSII:
Do obliczenia aktywności PSII, wyciągnięto średnią z pomiarów absorbancji. Wyniki zestawiono w tabeli numer 3.
Tabela nr.3
Czas oświetlania
Średnia absorbancja(bez DCMU)
1,619
20
1,494
40
1,401
1,381
80
1,389
Wyniki z 2 pomiarów przedstawiono na wykresie numer 4.
A = ε c l c= A/ k*l l = 1 cm ε = 16000 M-1cm-1
więc:
Cm=1,619/16000*1=0,000101mol/ dm3=101µmol
Cm=1,494/16000*1=0,0000933 mol/ dm3= 93,3 µmol
Del.Cm=5.5µmol/dm3
5,5µmol-1000ml
x - 2ml
x=11 nmol
Masy molowe chlorofili:
a = 893,5 g/mol
b = 907,5 g/mol
...
paulinka88x