I Biochemia cytologiczna i histologiczna.doc

I Biochemia cytologiczna i histologiczna.

Wykrywanie podstawowych składników chemicznych w komórkach i tkankach

1. Białka

Białka są podstawowymi składnikami budulcowymi (strukturalnymi) komórek organizmu. Oprócz funkcji strukturalnych, białka pełnią różnorakie funkcje metaboliczne, szczególnie dotyczy to enzymów, tzw. biokatalizatorów w organizmach żywych. Białka są związkami wielkocząsteczkowymi (powyżej 10 000 kD). Cząsteczki białek prostych (proteiny) utworzone są tylko przez aminokwasy, podczas gdy w skład białek złożonych (proteidy) wchodzą obok aminokwasów związki niebiałkowe (grupa prostetyczna). Ponadto regulują ciśnienie osmotyczne płynów wewnątrz- i pozakomórkowych oraz stężenie jonów wodorowych. Niektóre pełnią rolę hormonów. Uczestniczą w krzepnięciu krwi, w transporcie związków metali, hormonów, enzymów oraz innych substancji, a także w procesach immunologicznych. Białka zawierające tryptofan i tyrozynę pochłaniają promienie UV. Mogą stanowić materiał energetyczny: utlenienie l g białka dostarcza 17 kJ energii1.

Pod wpływem metali ciężkich, zasad, kwasów, alkoholi, garbników, mocznika, podwyższonej temperatury (ponad 56°C) ulegają denaturacji. Denaturacja polega na nieodwracalnej zmianie konformacji i stopnia uwodnienia białka. Zniszczeniu ulegają wtedy mostki wodorowe i disulfidowe.
W białkach powszechnie występuje 22 aminokwasy (patrz tab. 1).

Tab. 1. Aminokwasy białkowe i ich skróty

1Jednostka ciepła - kaloria /cal/ nie należy do układu SI, jednakże jest powszechnie stosowana w tabelach fizjologicznych i dietetycznych. Jednostką energii w układzie SI jest dżul (J); l cal = 4,184 J; l kcal = 4,184 kJ.

Połączone są one ze sobą za pomocą wiązania peptydowego -CO-NH-. Utworzenie wiązania peptydowego wiąże się z wydzieleniem wody. Wiązania peptydowe wykrywa się za pomocą reakcji z jonami miedzi (2+) w środowisku zasadowym. Związek zawierający w składzie do 10 aminokwasów nosi nazwę oligopeptydu (np. glutation), a powyżej 10 aminokwasów (do 100) — polipeptydu (np. adrenokortykotropina). Wiązania peptydowe wykrywa się za pomocą reakcji z jonami miedzi (2+) w środowisku zasadowym.

Sekwencja i liczba aminokwasów w białku określa I-rzędową strukturę białka. Łańcuchy aminokwasowe nie występują w formie wyprostowanej, lecz są pofałdowane (harmonijkowe) lub helisowe. Zagięcia łańcucha są zapewnione przez dodatkowe wiązania wodorowe pomiędzy grupami -CO i -NH-. Jest to struktura II-rzędowa. Struktura III-rzędowa powstaje na skutek działania wiązań wodorowych, jonowych i hydrofobowych. Dzięki temu tworzy się trójwymiarowy przestrzenny układ pofałdowanych łańcuchów białka, z łańcuchami bocznymi stabilizującymi całą strukturę. Szczególna rolę odgrywają wówczas wiązania dwusiarczkowe. (po utlenieniu grup -SH). Niektóre białka, głownie enzymatyczne zbudowane są z agregatów łańcuchów polipeptydowych — z podjednostek. Sposób połączenia podjednostek tworzy strukturę IV-rzędową. W tym przypadku ważne są siły Van der Waalsa, mostki siarczkowe i wodorowe oraz wiązania hydrofobowe.

Roztwory białek są roztworami rzeczywistymi (cząsteczkowymi), jednakże ze względu na duże rozmiary cząsteczek (5-10 nm) wykazują właściwości roztworów koloidalnych. Proces przechodzenia osadu w zol nazywamy peptyzacją, a proces wytracania osadu, tj. przechodzenie zolu w żel - koagulacją. W roztworze cząsteczki białka mają określony ładunek elektryczny, na skutek dysocjacji grupy -NH2 i -COOH znajdujących się w resztach aminokwasowych łańcuchów polipeptydowych. Dysocjacja tych grup powoduje wytworzenie ładunków elektrycznych: -NH3 i –COO-. Obecność ładunku elektrycznego powoduje, ze cząsteczki białek mają właściwości hydrofilne i tym samym zdolność pochłaniania wody oraz pęcznienia. Białka są więc związkami amfoterycznymi z uwagi na obecność wolnych grup —COOH (np. kwas glutaminowy, kwas asparaginowy) i -NH2 (lizyna, amid kwasu glutaminowego, amid kwasu asparaginowego).

W zależności od pH środowiska cząsteczki białka wędrują w polu elektrycznym do anody lub katody. Migracja cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym nosi nazwę elektroforezy. pH, przy którym wypadkowy ładunek białka wynosi O nazywa się punktem izoelektrycznym białka (pI); innymi słowy pI jest to wartość pH przy której cząsteczki białka nie poruszają się. Dzięki tym właściwościom można rozdzielać mieszaninę białek. Ze względu na wartość pI białka dzielimy na trzy grupy:

 białka kwaśne, z przewagą wolnych grup -COOH, np. kazeina, niektóre białka surowicy;

 białka zasadowe, z przewagą wolnych grup aminowych, np. histony;

 białka obojętne, których pI przypada na pH 7,0, np. niektóre białka surowicy.

Punkt izoelektryczny zależy od warunków środowiska: pH, temperatury, siły jonowej elektrolity, rodzaju użytego nośnika.

Wartością stałą białek jest punkt izojonowy, zależny od sekwencji i liczby aminokwasów w makrocząsteczce. Jest to wartość pH przy której liczba protonów związanych z -NH2 jest równa liczbie protonów oddanych przez grupę -COOH.

Enzymy trawiące białka do aminokwasów (hydrolazy peptydowe = peptydazy, enzymy proteolityczne) katalizują hydrolizę wiązania peptydowego:

-CO-NH- + H2O ---> -COO- + NH3+

Endopeptydazy rozrywają cząsteczki białka wewnątrz łańcucha peptydowego. Egzopeptydazy działają na końce łańcuchów, oddzielając od nich aminokwasy. Karboksypeptydazy odłączają aminokwas z końca łańcucha z wolną grupą -COOH. Aminopeptydazy odłączają aminokwasy od końca łańcucha z wolną grupą -NH2.

Ze względu na kształt cząsteczki wyróżnia się białka fibrylarne i globularne. Wydłużone cząsteczki białka fibrylarnego zbudowane są z rozciągniętych łańcuchów polipeptydowych. Białka te nie rozpuszczają się w wodzie i oporne są na działanie enzymów. Przykładami są keratyna (włosy, wełna, naskórek) i kolagen (tkanka łączna) bogate w cysteinę.

Białka globularne mają kształt eliptyczny i są najczęściej dobrze rozpuszczalne w wodzie oraz w roztworach soli. Spośród licznych białek globularnych należy wymienić:

1. Albuminy. Są białkami rozpuszczalnymi w wodzie. Obecne w mleku, w komórkach jajowych, we krwi, w ziarnach zbóż. Mają masę cząsteczkową około 70000 (albuminy krwi 69000). Zawierają głównie kwas asparaginowy, argininę i kwas glutaminowy.

2. Globuliny. Obecne w mleku, w mięśniach, w osoczu krwi (40% białka całkowitego)
i w spermie. Trudno rozpuszczalne w wodzie, łatwiej - w roztworach soli. Mają masę cząsteczkowa powyżej 100.000. Globuliny osocza krwi obejmują frakcję alfa1, alfa 2,
beta i gamma. Frakcja gamma to immunoglobuliny.

3. Histony. Zasadowe białka wchodzące w skład chromatyny jądra komórkowego. Wyróżnia się 5 klas histonów, różniących się stosunkiem argininy do lizyny, masa cząsteczkową i relacją ilościową aminokwasów zasadowych do aminokwasów kwaśnych. Histony H 1 (m.cz. 21.000) są bogate w lizynę. Histony H2A (m.cz. 14.500)
i H2B (m.cz. 13.800) są średnio bogate w lizynę. Histony H3 (m.cz. 15.300) i H4 (m. cz. 11.300) są bogate w argininę.

4. Protaminy. Występują w spermie ssaków i ryb w powiązaniu z kwasami nukleinowymi. Są zasadowymi polipeptydami. Zawierają argininę, lizynę i (lub) histydynę. Przedstawicielem może być klupeina (mlecz śledzi), salmina (mlecz łososi), skombryna (mlecz makreli).

5. Prolaminy. Występują w ziarnach traw (składnik glutenu). Są białkami kwaśnymi, pozbawionymi lub ubogimi w lizynę; bogatymi w prolinę i oksyprolinę Rozpuszczają się w alkoholach. Masa cząsteczkowa 30000-50000.

6. Gluteliny. Obecne w nasionach traw. Rozpuszczają się w roztworach kwasów i zasad. Nierozpuszczalne w etanolu 70%. Składnik glutenu.

W organizmie człowieka białka tworzą połączenia z innymi związkami chemicznymi:

1. Fosfoproteidy zawierają kwas fosforowy estrowo związany z grupami -OH seryny i treoniny. Przykładem jest kazeina mleka (0,71% fosforu). W mleku kazeina występuje w postaci soli wapniowych, jako kazeinian wapnia. Można ją wytrącić za pomocą podpuszczki, roztworów soli (Na2SO4(NH...