MIKROBIOLOGIA ćw.3
Hodowla Drobnoustrojów
Hodowla – pożywka płynna lub stała z rozwijającymi się na niej lub w niej drobnoustrojami.
Hodowla:
- czysta: zawiera jeden gatunek drobnoustrojów,
- mieszana: zawiera drobnoustroje z różnych gatunków.
Cel hodowli:
- wyhodowanie drobnoustrojów z materiału klinicznego,
- ocena morfologii kolonii bakteryjnej,
- określenie niektórych cech metabolicznych np. zdolności do rozkładu laktozy, mannitolu czy es kuliny, zdolności do wzrostu w warunkach tlenowych bądź beztlenowych, zdolności do hemolizy.
Techniki posiewu:
Posiew – zakładanie kolonii(hodowli).
- podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej i mikrobiologicznej zarówno w mikrobiologii klinicznej jak i badawczej to metoda uzyskiwania pojedynczych odosobnionych kolonii bakterii, czy grzybów na podłożach mikrobiologicznych,
- narzędziem obecnie używanym do posiewu jest eza.
Rodzaje posiewu:
1.Metoda uproszczona:
2.Posiew redukcyjny:
- umożliwia uzyskanie czystej kultury bakterii na prawidłowo posianej płytce po całonocnej inkubacji można zaobserwować pojedyncze kolonie bakterii.
- każda kolonia to potomstwo jednej bakterii, aby była widoczna gołym okiem, kolonia musi zawierać około 107 komórek.
- stosuje się do przesiewania bakterii z podłóż stałych.
Należy pamiętać, że każdorazowo przed rozsianiem materiału opalamy ezę w płomieniu palnika.
Materiał mikrobiologiczny nanosimy tylko raz.
Metody wysiewania na podłożu stałym wylanym do probówek:
- przechowywanie szczepów identyfikujące na podstawie wzrostu na odpowiednich podłożach.
Metoda seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń pozwala bardzo dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie.
X – od -5 do -10
a) Metoda Hoepricka: używać można jedynie do wysiewu materiału płynnego.
b)Posiew murawowy:
- do określania miana hodowli komórki bakteryjnej,
- przy wysokim stopniu rozcieńczenia hodowli (~10-6) uzyskuje się pojedyncze kolonie bakteryjne.
- oznaczenie wrażliwości bakterii chemoterapeutyki.
- w celu uzyskania max liczby trans formatów,
- w celu uzyskania max liczby transduktantów.
c)posiew kłuty : wykonuje się wkłuwając ezę w słupek,
d)posiew rysowy: przeprowadza się na powierzchni skosu agarowego.
Wykonując posiew:
- na podłożu płynnym należy pobrać ezą badany materiał, a następnie zaznaczyć w probówce z pożywką i lekko potrząsając ezą wypłukać materiał z oczka,
- na skosie agarowym pobieramy ezą badany materiał a następnie dotykamy ezą powierzchni skosu i ruchem falistym lub zygzakowatym przeciągamy ezę po powierzchni podłoża w kierunku wylotu probówki,
- na płytce Petriego odrobinę badanego materiału rozprowadza się zygzakiem lub promieniście na całej powierzchni zestalonego podłoża agarowego lub też dzieli się je na sektory i w nich rozprowadza materiał.
Po wykonaniu posiewu:
- bakterie inkubujemy w cieplarkach (37°C),
- po inkubacji płytki przechowywane są w chłodniach (lodówce+4°C do 10°C),
- w chłodni przechowuje się także wszystkie jałowe pożywki mikrobiologiczne.
Warunki hodowli drobnoustrojów:
- czynniki fizyczne(temperatura),
- czynniki chemiczne(kwasowość, tlenowość),
- zawartość składników odżywczych (rodzaje pożywek).
Temperatura:
- bardzo szerokim zakresie temperaturowym od -23°C do 113°C,
- większość mikroorganizmów 10-37°C, warunkach laboratoryjnych temperatura dla bakterii to 30-37°C, a dla grzybów 20-25°C.
Podział drobnoustrojów ze względu na różnicę w temperaturze wzrostu:
1.Psychrofilne (-23-0;15;20°C), bakterie Gram ujemne należące do rodzaju Pseudomonas oraz Vibrio, Acinetobacter, bakterie Gram dodatnie: Micrococcus, Bacillus oraz Lactobacillus, drożdże-Candiola spp. Zatrucia pokarmowe stwarzają: Listeria monocytogenes, Kersinia enterocolitica i Bacillus cereus.
2.Mezofilne (10-30;20-37;35-50°C) większość drobnoustrojów występujących w środowisku (glebie, wodzie, na powierzchni ciała, roślin, zwierząt) mikroorganizmy saprofityczne oraz chorobotwórcze dla roślin, zwierząt i człowieka wywołują zatrucia pokarmowe.
3.Termofilne (25-45;46-65/80;60-90°C) bakterie Gram dodatnie, przetrwalnikujące należące do rodzaju Bacillus, Streptococcus, Lactobacillus.
Tlenowość – potencjał oksydacyjno – redukcyjny:
1.Bezwzględne tlenowce (potrzebują tlenu)
- Bacillus spp., Micrococcus spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp., Penicillium spp.
2.Względne beztlenowce (wzrost w warunkach tlenowych 2-8% O2 lub beztlenowych)
- Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp.
3.Mikroaerofile (wymagają tlenu jako końcowego akceptora elektronów, jednak jego stężenie w atmosferze powinno być obniżone 5% O2)
- Helicobacter pylori.
4.Bezwzględne beztlenowce (nie są zdolne do wzrostu jeśli zawartość tlenu w atmosferze przekracza 0,5%)
- rodzaj Clostridium.
Wzrost na podłożu płynnym:
1 – bezwzględne tlenowce
2 – bezwzględne beztlenowce
3 – mikroaerofile
4 – względne beztlenowce
Podział ze względu na kwasowość:
1.Alkalofile – rozwijające się w środowisku alkalicznym (pH 8-11).
- Vibrio cholerae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Bacillus spp.
2.Neutrofile (pH 6,5-7).
3.Acidofile (pH 2-5).
Cechy charakterystyczne podłoża:
- Odpowiednia zawartość substancji odżywczych,
- odpowiednie pH,
- jałowość,
- klarowość i jednorodność.
PODZIAŁ PODŁOŻY
1. Ze względu na konsystencję:
a)płynne (bulion mięsny),
b)półpłynne(0,5-1% agar),
c)stałe(>1% agar).
2. Ze względu na zawartość substancji:
a)syntetyczne,
b)półsynetyczne,
c)naturalne.
3. Ze względu na ilość i jakość składników odżywczych:
a)proste (podstawowe) niskie wymagania
- woda peptonowa, bulion mięsny, agar zwykły, żelatyna.
b)złożone (wzbogacone)
- agar z 5% krwią baranią, agar Mueller-Hintona do antybiotyków,
- dla bakterii o wysokich wymaganiach.
3 rodzaje hemolizy:
- α hemoliza – częściowa, objawia się zielonkawym zabarwieniem wokół wzrastającej kolonii,
-β hemoliza – całkowita, objawia się przejaśnieniem wokół wzrastającej kolonii,
-γ - brak hemolizy.
I. Wybiórczo – namnażające:
- rosną na nich określone drobnoustroje,
- bulion z żółcią do hodowli Salmonella spp. (hamuje wzrost bakterii Gram dodatnich),
-podłoże SS – dla Salmonella i Shigella (hamuje rozwój pałeczek z rodzaju Escherichia i rodzaju Profeus), szczepy wytwarzające H2S (Salmonella spp) tworzą kolonie z czarnymi środkami.
II. Wybiórczo różnicujące:
- rosną na nich wybrane bakterie i są one różnicowane na drodze właściwości biochemicznych,
1. Podłoże Chapmana dla gronkowców:
- czynnik wybiórczy :7,5% NaCl (hamuje rozwój większości drobnoustrojów),
- czynnik różnicujący: mannitol (Staphylococcus aureus fermentuje mannitol zakwaszając środowisko- duże kolonie otoczone żóltą strefą, Staphylococcus epidermidis – małe kolonie żółtego zabarwienia).
2. Podłoże MacConkey’a (MCA) dla pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae.
- czynnik wybiórczy: dezoksycholan sodu i fiolet krystaliczny – hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich.
- czynnik różnicujący: laktoza- bakterie rozkładające laktozę tworzą różowo zabarwione kolonie (np. escherichia coli), bakterie nierozkładające laktozy – kolonie przezroczyste (np. Proteus vulgaris)
- pałeczki rozkładające dezoksycholan sodu daje wokół kolonii strefę wytrącanego kw. .Dezoksycholowego.
3. Podłoże z azydkiem sodu (DCA) dla paciorkowców kałowych.
- czynnik wybiórczy: azydek sodu – pozwala na wzrost paciorkowców,
- czynnik różnicujący: es kulina – rozkładana przez Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium daje czarne zabarwienie podłoża.
4. Podłoże z cetrymidem (PYA) dla Pseudomonas aeruginosa.
- cetrymidem dodany do podłożam hamuje wzrost bakterii Gram(+) i większości Gram(-), Anie hamuje wytwarzania piocyjaniny.
Pseudomonas ma zielony lub niebieski, żółty kolor i charakterystyczny zapach jaśminu
5.Podłoże Sabourauda
-wybiórcze dla grzybów (obniżone pH, zawiera antybiotyki : cykloheksamid i chloramfenikol).
III. Podłoże specjalne:
- hodowla drobnoustrojów wybrednych, o specjalnych wymaganiach wzrostowych.
1.Agar czekoladowy
- zawiera hemolizowaną krew (otrzymuje się przez zagotowanie agaru z krwią, proces ten uwalnia czynniki wzrostowe krwinek X i V). X-NAD+ V – hemina
- Haemophillus spp., Neisseria spp.
2. Podłoże Löfflera (zawiera ściętą surowicę końską dla Corynebacterium diphteriae) – skośne w probówce.
3. Podłoże Lowensteina – Jensena dla Mycobacterium tuberculosis(prątek gruźlicy) – na skosie stałym.
- zawiera zieleń malachitową, która hamuje wzrost innych drobnoustrojów.
4. Bulion z tioglikolanem sodu do hodowli bakterii beztlenowych – półpłynne.
Podłoża transportowe:
- umożliwiają przeżycie bakterii podczas transportu.
Podłoża transportowo-namnażające:
- ich skład chemiczny umożliwia namnażanie się bakterii podczas transportu.
Metody Hodowli Bakterii Beztlenowych:
- wytworzenie ujemnego potencjału oksydoredukcyjnego, w tym celu stosowane są następujące metody:
a)fizyczne: podłoża przygotowane są na świeżo lub regenerowane przez zagotowanie i gwałtowne ochłodzenie w przypadku podłoży płynnych.
Płytki z podłożem umieszcza się w an aerostatach, z których usuwa się tlen na drodze reakcji chemicznych w generatorach lub przez zastąpienie powietrza gazem obojętnym.
b)chemiczne: do podłoża dodaje się substancje obniżające potencjał oksydoredukcyjny np. kw. Tioglikolanowy i rezazurynę jako wskaźnik.
c)biologiczne: na jednej części podłoża posiewany jest drobnoustrój bezwzględnie tlenowy np. Bacillus subtillis, który pochłania tlen, a na drugiej części drobnoustrój beztlenowy (płytki oklejone są para filmem) Skład podłoża jest optymalny dla obu gatunków.
Specjalna aparatura:
- eksykatory próżniowe lub an aerostaty,
- generatory i odtleniacze chemiczne.
Hodowla Mikroaerofili:
- rosną w środowisku o zmniejszonej zawartości tlenu atmosferycznego,
-oprócz firmowych generatorów stosuje się specjalne eksykatory i cieplarki z przepływem CO2.
sylwinka20a