11. ANALIZA ILOŚCIOWA PREPARATÓW MIKROSKOPOWYCH
Metody analizy ilościowej preparatów mikroskopowych dzielimy na:
· metody fotometryczne (densytometria, czyli pomiary gęstości optycznej badanych struktur, oraz fluorymetria, czyli pomiary intensywności fluorescencji emitowanej przez te struktury);
· metody morfometryczne, mierzące parametry geometryczne badanych struktur (liczebność, wymiary, pola, itp.).
Dalsza analiza uzyskanych danych liczbowych pozwala na określenie ilościowych proporcji cech morfologicznych oraz uporządkowania tych cech pod względem ich nasilenia.
Analiza ilościowa umożliwia obiektywne (niezależne od błędów, jakie może popełnić obserwator) ustalenie charakterystyki morfologicznej badanych struktur i jej zmienności wywołanej działaniem eksperymentalnym (porównanie preparatu kontrolnego z doświadczalnym) bądź czynnikami patologicznymi (porównanie tkanki zdrowej ze zmienioną chorobowo).
11.1. Densytometria i fluorymetria
11.1.1. Fizyczne podstawy densytometrii
W densytometrii mierzy się pochłanianie światła przechodzącego przez preparat, które zależne jest od gęstości optycznej (intensywności zabarwienia) badanej struktury. Pomiary densytometryczne opierają się na prawie Lamberta-Beera mówiącym, iż gęstość optyczna jednorodnej warstwy pochłaniającej światło jest proporcjonalna do ilości substancji pochłaniającej, przez którą światło przechodzi:
A = k · c · l, gdzie
A = gęstość optyczna,
k = współczynnik pochłaniania światła dla danej substancji,
c = stężenie substancji w warstwie,
l = grubość warstwy.
Oznaczałoby to, że np. w preparacie z reakcji histochemicznej gęstość optyczna zabarwionych struktur jest wprost proporcjonalna do ilości barwnego produktu reakcji w danym obszarze preparatu, a zatem do ilości wykrywanego metodą histochemiczną związku chemicznego. Można więc na tej podstawie obliczyć względną ilość wykrywanego związku w różnych strukturach obecnych w preparacie oraz wyrazić liczbowo różnice stężenia tego związku pomiędzy poszczególnymi strukturami.
Analogiczna zależność istnieje pomiędzy intensywnością fluorescencji emitowanej przez warstwę fluoryzującą a stężeniem zawartej w niej fluoryzującej substancji, co stanowi podstawę dla pomiarów fluorymetrycznych.
Materiały biologiczne nie stosują się niestety w pełni do prawa Lamberta-Beera. Po pierwsze, obecne w preparacie struktury z reguły nie są jednorodne, jako że składają się z elementów komórkowych i pozakomórkowych (np. włókien) tworzących złożone utkanie. Po drugie, nie wszystkie barwniki wykazują proporcjonalny do ich stężenia wzrost pochłaniania światła, a ponadto pochłanianie to jest różne dla różnych długości fal świetlnych.
11.1.2. Metodyka pomiarów densytometrycznych i fluorymetrycznych
Podstawowym warunkiem wiarygodności pomiaru densytometrycznego jest oświetlenie preparatu światłem monochromatycznym (o określonej długości fali) oraz pomiar absorbcji światła również o określonej długości fali. Wynik pomiaru uzyskuje się przez porównanie intensywności światła dochodzącego do preparatu z intensywnością światła po przejściu przez preparat. Przy ocenie porównawczej wielu preparatów mikroskopowych decydująca o wiarygodności wyników jest jednakowa grubość preparatów (np. skrawków).
Jeżeli jednorazowy pomiar obejmuje dużą powierzchnię preparatu, obarczony jest błędem wynikającym z niejednorodności morfologicznej struktur obecnych w mierzonym polu. Pomiar bardzo małego pola (np. pojedynczej komórki) może spełniać warunek jednorodności, natomiast nie jest reprezentatywny dla całego preparatu (mogą się w nim znajdować komórki o różnej intensywności zabarwienia).
Rozwiązaniem optymalnym jest zatem wykonanie w jednym preparacie wielu pomiarów małych pól. Można tego dokonać albo przesuwając preparat ręcznie (np. wybierając jedynie zabarwione komórki), albo korzystając z automatycznie przesuwanego stolika przedmiotowego mikroskopu (skanowanie preparatu). Uzyskane z wielu pomiarów dane trzeba potem poddać analizie statystycznej.
11.1.3. Urządzenia stosowane w densytometrii i fluorymetrii
Mikrodensytometry są urządzeniami specjalnie skonstruowanymi do tego typu pomiarów. Składają się z części mikroskopowej, części densytometrycznej oraz komputera służącego do rejestracji, przetwarzania oraz analizy statystycznej danych pomiarowych, której wyniki mogą być również przedstawione w formie graficznej.
Przystawki mikrodensytometryczne to urządzenia o prostszej konstrukcji, które można dołączyć do mikroskopu.
Mikrospektrofotometry są najbardziej skomplikowaną wersją urządzeń do pomiarów densytometrycznych. Umożliwiają one oświetlenie preparatu światłem o dowolnie wybranej długości fali oraz analogiczny odczyt jego absorbcji. Przy ich pomocy można np. testować charakterystykę optyczną nowych barwników, określając długość fali świetlnej, przy której absorbcja jest największa lub najbardziej proporcjonalna do stężenia.
Mikrofluorymetry służą do pomiaru intensywności fluorescencji emitowanej przez struktury w preparacie. Wynik liczbowy uzyskuje się przez porównanie fluorescencji emitowanej przez badaną strukturę z fluorescencją tzw. standardu (roztwór fluorochromu o znanym stężeniu). Część mikroskopowa fluorymetru zbudowana jest zgodnie z zasadami konstrukcji mikroskopu fluorescencyjnego z epiiluminacją (żródło światła UV, odpowiednie filtry i oświetlenie preparatu od góry).
Mikrospektrofluorymetry umożliwiają regulację w szerokim zakresie zarówno długości fal światła UV padającego na preparat, jak i światła mierzonego, emitowanego przez zawarte w preparacie struktury.
11.2. Cytometria przepływowa
Jest to metoda pomiaru własności fizycznych i chemicznych komórek przygotowanych w formie zawiesiny, które pojedynczo przepływają przez rejon pomiaru. Odczyty z każdej komórki są następnie liczone i analizowane statystycznie przez komputer. Z uwagi na bardzo dużą liczbę komórek (rzędu 106 i więcej) analizowanych w trakcie jednego badania, wyniki statystyczne są w pełni miarodajne.
Cytometria nie należy wprawdzie do metod oceny klasycznego preparatu mikroskopowego, ale jest odmianą mikrofluorymetrii, stanowiąc alternatywę dla badań mikroskopowych, coraz szerzej wykorzystuje się ją w diagnostyce laboratoryjno-klinicznej, a przygotowanie komórek do pomiaru obejmuje metody cytochemiczne i immunocytochemiczne. Względy te przemawiają za włączeniem jej do technik przedstawianych w tym podręczniku.
11.2.1. Fizyczne podstawy pomiaru cytometrycznego
W chwili przepływu przez rejon pomiaru komórka przecina wąski promień świetlny, który:
· ulega rozproszeniu zależnemu od wielkości komórki, jej kształtu oraz własności optycznych (np. ziarnistości) cytoplazmy;
· wzbudza fluorescencję substancji chemicznych, którymi komórka była uprzednio znakowana.
Stopień rozproszenia światła oraz intensywność wzbudzonej fluorescencji są mierzone przez odpowiednie detektory o bardzo dużej czułości.
11.2.2. Budowa cytometru
Cytometr składa się z kilku podstawowych zespołów:
Komora wstępna - zawiera zawiesinę komórek przeznaczonych do pomiaru. Zawiesina ta jest stale mieszana, aby zapobiec sklejaniu się komórek w skupiska, i pompowana poprzez filtr przepuszczający wyłącznie pojedyncze komórki do bardzo wąskiego przewodu, w którym komórki mogą się przemieszczać tylko pojedynczo, jedna za drugą.
Komora przepływu - strumień zawiesiny z szeregowo przepływającymi komórkami ulega tu ostatecznemu uformowaniu i otoczeniu cienkim płaszczem płynu, zapewniającym równomierny i pozbawiony zawirowań przepływ przez rejon pomiaru (ryc. 11.1). Wypływający przez bardzo mały otwór strumień ma średnicę 50-250 mm, a jego środkowy obszar zawierający komórki 10-30 mm. Szybkość przepływu wzrasta tu do 1-10 m/sek. Poprzez odpowiednią regulację proporcji zawiesiny komórkowej i płynu otaczającego można zmieniać gęstość komórek w strumieniu.
Źródło promieniowania wzbudzającego - laser emitujący bardzo wąski (20-100 mm) promień światła o długości fali dostosowanej do charakterystyki używanego fluorochromu (np. 488 nm dla fluoresceiny). Promień ten przecina strumień zawiesiny komórek.
Detektory - cytometr wyposażony jest przeważnie w kilka niezależnie pracujących detektorów odczytujących intensywność światła rozproszonego i fluorescencji o różnych długościach fal. W ten sposób podczas pojedynczego odczytu można zmierzyć kilka różnych parametrów tej samej komórki. Czas odczytu jest bardzo krótki (ułamki milisekundy), jego efektem jest wysłanie przez detektor impulsu elektrycznego o wielkości proporcjonalnej do natężenia odebranego sygnału świetlnego.
System przetwarzania sygnału. Wysyłane przez detektory impulsy elektryczne przetwarzane są z formy analogowej w cyfrową. W tej formie kodowane są następujące parametry sygnału:
- amplituda (zależna od intensywności światła),
- czas trwania (zależny od wielkości struktury emitującej światło)
- tzw. powierzchnia sygnału, odpowiadająca całkowitej ilości światła wyemitowanego przez komórkę.
Komputerowy system analizy danych. Zakodowane w formie cyfrowej dane dostarczane są do komputera, który na podstawie odpowiedniego programu dokonuje ich analizy statystycznej i przedstawia wyniki w formie graficznej. Może to być analiza jednoczynnikowa, w wyniku której uzyskujemy dwuwymiarowy histogram, analiza dwuczynnikowa przedstawiona w formie wykresu trójwymiarowego, scattergramu lub mapy konturowej, możliwa jest też analiza wieloczynnikowa. Otrzymane informacje dotyczą rozkładu ilościowego komórek różniących się wielkościami badanych parametrów, możliwe jest też wyodrębnienie kilku populacji komórek na podstawie różnic ich własności.
Cytometr może być wyposażony w sortownik komórek, umożliwiający fizyczne podzielenie analizowanych komórek na trzy grupy różniące się własnościami. Urządzenie to działa na stosunkowo prostej zasadzie: tuż za obszarem pomiaru strumień zawiesiny komórkowej poddawany jest działaniu ultradźwięków, które dzielą go na mikroskopijne kropelki - tak małe, by w pojedynczej kropli mogła się zmieścić tylko jedna komórka. Następnie krople przepływają przez szybko zmieniające się (zależnie od wyniku pomiaru) pole elektromagnetyczne, które nadaje kropli ładunek dodatni, ujemny, bądź żaden. Ostatnie, tym razem stałe pole elektromagnetyczne wpływa na kierunek przepływu pojedynczych kropli w zależności od ich ładunku: krople z ładunkiem dodatnim odchylane są w jedną stronę, z ładunkiem ujemnym w stronę przeciwną, a pozbawione ładunku nie zmieniają kierunku przepływu. Tak posortowane kropelki zawierające pojedyncze komórki zbierane są w trzech oddzielnych pojemnikach.
Ryc. 11.2 przedstawia schemat budowy cytometru wyposażonego w sortownik komórek.
11.2.3. Przygotowanie komórek do pomiarów cytometrycznych
Z uwagi na konieczność wytworzenia zawiesiny komórkowej, do badań cytometrycznych nadają się najlepiej komórki, które już w warunkach fizjologicznych zawieszone są w płynach ustrojowych, lub też są bardzo luźno związane z tkanką (komórki krwi, szpiku krwiotwórczego, narządów limfatycznych, komórki uzyskane z jam ciała) oraz komórki hodowane. Badanie komórek wchodzących w skład tkanek litych możliwe jest jedynie po ich uprzedniej izolacji przy zastosowaniu enzymów hydrolitycznych, trawiących wiążącą komórki substancję międzykomórkową.
W zależności od przedmiotu badań, komórki muszą być odpowiednio znakowane barwnikami fluorescencyjnymi. W przypadku badania kwasów nukleinowych stosuje się barwniki swoiście wiążące się z DNA (DAPI, Hoechst, jodek propidyny, bromek etydyny). Możliwość badania bardzo szerokiego spektrum antygenów, zarówno powierzchniowych jak i wewnątrzkomórkowych, stwarzają techniki immunocytochemiczne, w których przeciwciała znakowane są fluorochromami (fluoresceiną, rodaminą, czerwienią teksańską, AMCA, fikoerytryną, allofikocyjaniną). Można również badać występowanie określonych genów, stosując metody hybrydocytochemii oraz obecność specyficznych grup cukrowcowych przy użyciu znakowanych fluorochromami lektyn.
11.2.4. Zastosowanie badań cytometrycznych
Poniższa tabela przedstawia własności komórek, które mogą być mierzone przy pomocy cytometrii przepływowej.
_____________________________________________________
Własności strukturalne Własności czynnościowe
kształt i wielkość komórek przepuszczalność błon
obecność ziarn w cytoplaźmie aktywność receptorów
obecność barwników w cytoplaźmie endocytoza
zawartość DNA, ploidia stężenie jonów Ca2+
struktura chromatyny pH wewnątrzkomórkowe
obecność określonych genów
zawartość białek
obecność określonych antygenów
obecność określonych cukrowców
organizacja cytoszkieletu
--------------------------------------------------------------------------------
Niezależnie od zastosowań w badaniach naukowych, cytometria przepływowa służy do diagnostyki:
· rozrostowych chorób układu krwiotwórczego (identyfikacja typów białaczek)
· zaburzeń układu immunologicznego
· stanu układu immunologicznego pacjentów poddawanych przeszczepom tkanek i narządów
· składu komórkowego guzów nowotworowych.
11.3. Morfometria
11.3.1. Planimetria
Struktury widoczne w preparacie mikroskopowym tworzą zazwyczaj wyodrębnione na płaszczyźnie dwuwymiarowe profile, które określamy mianem obiektów. Takimi obiektami są np. jądra komórkowe (planimetria jąder nosi nazwę kariometrii), komórki lub ich grupy (powierzchnie nabłonkowe, cewki gruczołowe, grudki chłonne, itp.), włókna substancji międzykomórkowych lub ich zespoły (blaszki i beleczki kostne), czy struktury biologiczne o wyższym poziomie organizacji (naczynia krwionośne, włókna nerwowe itp.). Obiekty każdego typu mogą być przedmiotem analizy morfometrycznej poprzez pomiar szeregu charakteryzujących je parametrów, takich jak np.:
· liczebność
· pole
· obwód
· długość i szerokość
· średnica.
Poprzez odpowiednie działania matematyczne można obliczyć dalsze parametry (m. in. gęstość, sumaryczne pole, obwód obiektów i współczynniki kształtu).
11.3.2. Stereologia
Analiza stereologiczna polega na matematycznym przekształcaniu dwuwymiarowego obrazu struktur w obraz trójwymiarowy. W tym celu konieczne jest uwzględnienie grubości analizowanego preparatu (np. skrawka) oraz skorelowanie badanego obrazu z układem odniesienia, którym są specjalne siatki testowe o określonym, sztucznie skonstruowanym układzie linii i punktów. Wyróżnia się siatki kwadratowe, heksagonalne i krzywoliniowe.
Siatki te nakłada się na obraz mikroskopowy, a następnie oblicza się parametry odniesienia badanych obiektów w obrazie mikroskopowym do punktów i linii siatki:
· liczbę trafień (liczba punktów siatki znajdujących się w obrębie badanych obiektów),
· liczbę przecięć (obiektów przez linie siatki)
· długość siecznych (odcinków linii siatki przechodzących w obrębie obiektu).
Uzyskane dane przekształca się zgodnie z określonymi wzorami matematycznymi, uzyskując wyniki dotyczące przestrzennej (trójwymiarowej) geometrii badanych struktur: ich objętości i gęstości przestrzennej (na jednostkę objętości).
11.3.3. Urządzenia stosowane w badaniach morfometrycznych
Najprostszymi urządzeniami do badań morfometrycznych są preparaty referencyjne oraz siatki pomiarowe i testowe zainstalowane w mikroskopach.
Preparat referencyjny posiada zamiast materiału biologicznego podziałkę, której linie odległe są od siebie o 10 mm lub 5 mm. Pozwala on na ustalenie rzeczywistych wymiarów liniowych obrazu i nakładanych na obraz siatek, które są oczywiście różne w zależności od powiększenia używanego obiektywu.
Siatki pomiarowe (do badań planimetrycznych) i testowe (do badań stereologicznych) umożliwiają dokonywanie pomiarów w mikroskopie lub na mikrofotografii. W pierwszym przypadku siatki rzutują się bezpośrednio na obraz preparatu, gdyż są umieszczone w okularze lub tubusie, a w mikroskopach projekcyjnych (wyposażonych dodatkowo w duży ekran-matówkę) nakłada się je na ekran.
Planimetr pozwala na szybkie obliczanie obwodów i pola obiektów widocznych w obrazie mikroskopowym. Klasyczny planimetr wyposażony jest w końcówkę, którą obrysowuje się badane obiekty na zdjęciach mikroskopowych lub przy użyciu dodatkowej przystawki rysunkowej wprost z obrazu mikroskopowego. Celowi temu może również służyć digitizer, który przekazuje obraz obrysowywanego obiektu w formie cyfrowej do pamięci komputera. Stosunkowo proste programy analizujące grafikę komputerową są w stanie dokonać opisu liczbowego takich obiektów.
11.4. Komputerowa (cyfrowa) analiza obrazu
Szybki rozwój techniki komputerowej stworzył możliwość automatycznego dokonywania pomiarów zarówno fotometrycznych jak i morfometrycznych poprzez wykorzystanie cyfrowej formy obrazu. To właśnie różni komputerową analizę obrazu od metod opisanych powyżej.
11.4.1. Przekształcanie obrazu mikroskopowego w formę cyfrową
...
carambola