1. Zasady pracy aseptycznej pod laminarem:
Aby praca pod wyciągiem laminarnym pozwoliła na zachowanie jak największej aseptyczności (jałowości) trzeba przestrzegać kilku zasad:
§ Pracujemy z podwiniętymi rękawami,
§ Nie nosimy podczas pracy biżuterii: pierścionków, obrączek, zegarków itp.,
§ Zabezpieczamy włosy przed opadaniem,
§ Nie rozmawiamy, nie żujemy gumy oraz nie kaszlemy (kichamy) w stronę wyciągu laminarnego,
§ Przed praca ręce myjemy antybakteryjnym mydłem i płuczemy 70% etanolem,
§ Zamykamy używane przez nas butelki i pojemniki, gdy z nich nie korzystamy,
§ Wszystkie przyrządy laboratoryjne – pipety itp. Wykorzystywane podczas pracy przechowujemy pod laminarem,
§ Po pracy wszystkie powierzchnie przemywamy 70% etanolem i naświetlamy promieniami UV.
2. Zalety i wady hodowli komórkowych:
Hodowlą komórkową nazywamy proces utrzymywanie komórek przy życiu, poza ich naturalnym środowiskiem – organizmem, w celu ułatwienia manipulacji eksperymentalnych i ich kontroli.
Zalety hodowli komórkowych
§ Ograniczenie wykorzystania zwierząt w eksperymentach,
§ Optymalizacja warunków hodowli – ze względu na zjawisko tzw. homogeniczności komórek jednej linii,
§ Ułatwienie kontroli środowiska zewnętrznego komórek,
§ Możliwość monitorowania różnych substancji i wydzielin bez interferencji innych substancji biologicznych występujących w środowisku naturalnym (in vivo).
Wady hodowli komórkowych:
§ Usunięcie ze środowiska hodowanych komórek różnego rodzaju komórek, hormonów, substancji chemicznych i struktur podporowych, z którymi te komórki oddziałują,
§ Niemożliwe jest laboratoryjne odtworzenie środowiska in vivo co powoduje, że hodowane komórki mogą zmieniać swoje właściwości (np. produkowane białka) pod wpływem zmienionych warunków środowiskowych.
3. Namnażanie komórek w hodowli, linie, zachowanie się komórek podczas namnażania:
Komórki możemy namnażać na różnego rodzaju podłożach, stosując wiele sposobów hodowli. W konsekwencji jednak, wszystkie te sposoby spowodują powstanie jednego z dwóch rodzajów hodowli komórkowych:
§ Hodowli pierwotnej – gdy komórki przeniesione są bezpośrednio z tkani do warunków in vitro,
§ Hodowli wtórnej – gdy komórki przeniesione zostały z hodowli pierwotnej, bądź hodowli wtórnej na kolejną płytkę – w kolejne warunki in vitro.
Liniami komórkowymi nazywamy komórki, które uległy mutacji nie ulegają już procesowi apoptozy po przejściu odpowiedniej liczby podziałów komórkowych – są nieśmiertelne.
Opisane na wykładzie sposoby zachowania się komórek podczas ich namnażania:
§ Zahamowanie kontaktowe – występuje wówczas, gdy namnażane komórki kontaktują się ze sobą i ich wzrost jest przez to hamowany. Komórki zatrzymują się wówczas w fazie wzrostu G0 cyklu komórkowego.
§ Uzależnienie od kotwiczenia – jest to zjawisko, w którym komórki namnażane na pewnym podłożu same wymagają obecności jakiejś powierzchni do wzrostu (przykładowo nie będą one wzrastały zawieszone w płynie, gdy nie będą dotykały ścianki naczynia).
4. Obserwacja hodowli komórek:
W celu obserwacji hodowli komórkowych stosujemy kilka metod, takich jak:
§ Obserwacja bezpośrednia w mikroskopie świetlnym komórek barwionych np. błękitem metylowym. Komórki rozpoznaje się wówczas po barwie – zdrowe komórki nie uległy zabarwieniu; martwe natomiast tak.
§ Oglądanie komórek w mikroskopie fazowym i ich ocena pod względem kształtu, konfluencji itp.
§ Obserwacja hodowli na podstawie zmian zachodzących w kolorze medium używanego w hodowli – biorąc pod uwagę, że zwykle świeże medium ma kolor jasnopomarańczowy, przy intensywnym wzroście bakterii zmienia barwę na żółtą, natomiast przy braku wzrostu (zbyt niski poziom dwutlenku węgla) zmienia barwę na fioletową.
5. Parametry definiujące środowisko hodowli tkankowych:
Parametrami na podstawie których możemy zdefiniować środowisko hodowli tkankowej i wybrać odpowiednią do hodowli macierz są:
§ Interakcje macierzy z komórkami hodowanymi - powinny być identyczne (zbliżone) jak w przypadku środowiska naturalnego,
§ Warunki fizyczne macierzy: jej geometria, struktura przestrzenna i występujące wewnątrz siły fizyczne,
§ Interakcje komórek hodowanych pod wpływem macierzy: w celu otrzymania odpowiednich interakcji stosujemy wysiewanie komórek przy odpowiedniej gęstości lub stosujemy kokultury (hodowle mieszane),
§ Występowanie w macierzy czynników stymulujących/hamujących rozpuszczalnych takich jak hormony czy neuroprzekaźniki.
6. Macierz zewnątrzkomórkowa - budowa i rola:
Macierzą komórkową nazywamy (ECM) nazywamy przestrzenie znajdujące się pomiędzy komórkami tkanki łącznej, a zajmowane przez substancje biologiczne produkowane przez te komórki.
Macierz komórkowa składa się z różnego rodzaju substancji biologicznych produkowanych przez tkankę łączną (jak napisałem wyżej, zresztą). Wśród tych substancji najważniejsze dla rozwoju hodowli komórkowej są białka włókniste (kolagen, elastyna, fibrynogen) – biorące udział w formowaniu struktury przestrzennej hodowli, oraz białka adhezyjne (fibronektyna, laminina) – biorące udział w przytwierdzaniu komórek do złoża.
Macierz komórkowa zapewnia hodowanym komórkom podporę fizyczną; odporność na wykruszenia, rozdarcia, wyginania, odpowiedni jonit – zestaw jonów występujących w środowisku pozakomórkowym; dostarcza substancji umożliwiających wzajemną komunikację komórek lub ich przemieszczanie.
7. Pomiary żywotności komórek:
Oznaczanie procentowej żywotności komórek można przeprowadzić przy pomocy mikroskopu świetlnego z odpowiednim powiększeniem, po uprzednim odbarwieniu preparatu odpowiednim barwnikiem – dowolnym barwnikiem, który pozwala na rozróżnienie komórek martwych od żywych (na przykład barwiąc tylko żywe lub martwe).
Po policzeniu komórek zarówno żywych, jak i martwych w polu widzenia mikroskopu uzyskane dane należy podstawić do wzoru: (liczba komórek żywych/całkowita liczba komórek) x 100%.
8. Cytoszkielet - rola, budowa, zmiany podczas hodowli komórek:
Ogólnie cytoszkieletem nazywamy sieć włóknistych struktur białkowych w komórce eukariotycznej, która nie pozwala na swobodne przemieszczenie się organelli i tworów komórkowych w cytoplazmie, a która sprawie, że znajdują się one w swojej ściśle określonej pozycji. Cytoszkielet składa się z trzech rodzajów włókien (filamentów):
§ Mikrofilamentów (filamentów aktynowych) – zwiniętych heliksalnie polimerów aktyny zwanych F-aktyną, zbudowanych z ciągle wydłużających się i skracających monomerów zwanych G-aktyną. Filamenty te mają średnicę od 5 do 9 nanometrów i znajdują się głównie w przykorowej warstwie cytoplazmy. Filamenty aktynowe biorą udział w nadawaniu kształtu komórce, ruchu pełzakowatym, tworzeniu wrzeciona podziałowego a także mikrokosmków.
§ Filamenty pośrednie – polimery, które w odróżnieniu od pozostałych fragmentów cytoszkieletu nie są wykonane z jakiegoś konkretnego rodzaju białka, ale z mieszaniny różnych białek np. keratyny, laminy, wimentyny (w różnych komórkach filamenty pośrednie mogą mieć różny skład chemiczny). Maja one średnicę około 10 nanometrów. Tworzą one rozgałęzioną, nieregularna sieć w cytoplazmie – jest ich szczególnie dużo w miejscach narażonych na rozciąganie lub inne urazy mechaniczne – ze względu na ich wyjątkową twardość.
§ Mikrotubule – puste w środku rurki będące o średnicy około 25 nanometrów, będące polimerami zbudowanymi z heterodimerów α+β tubuliny. Mikrotubule ulegają ciągłej przebudowie na skutek polimeryzacji lub depolimeryzacji cząsteczek tubuliny – przy czym proces ten jest niezwykle szybki, co sprawia, że mikrotubule w stanie ‘niezmienionym’ znajdują się około 10 minut. Do mikrotubul przyczepione są różnego rodzaju białka określane wspólną nazwą MAP, które umożliwiają transport różnego rodzaju pęcherzyków i organelli zakotwiczając je do (de)polimeryzujących mikrotubul.
9. Mikroskopia fluorescencyjna – barwniki, techniki:
Jest to rodzaj mikroskopii używanej w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych, oparty na wykorzystaniu zjawiska fluorescencji i fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskiem odbicia i absorpcji światła (mikroskopia optyczna). W technice tej fluorescencja próbki może być pochodzenia naturalnego (np. fluorescencja chlorofilu) lub wynikiem dołączenia do (kowalencyjnie lub przez jakikolwiek inny typ oddziaływania fizyko-chemicznego pomiędzy substancjami) do elementów obserwowanej próbki fluoroforów, czyli związków które fluoryzują po wzbudzeniu światłem odpowiedniej długości. Drugi sposób wykorzystywany jest znacznie częściej, szczególnie w biologii molekularnej, gdyż pozwala on na wyznakowanie odpowiednich (praktycznie wszystkich) struktur chemicznych w interesujących nas próbkach. (Nie wiem czy to wystarczy!!!)
10. Komórki macierzyste – typy i rozwój:
Komórki macierzyste to inaczej komórki pnia. Komórki które wykazują jednocześnie dwie charakterystyczne cechy:
§ Zdolność do potencjalnie nieograniczonej liczby podziałów,
§ Możliwość różnicowania się do innych typów komórek.
Dzięki tym dwóm cechom komórki macierzyste zdolne są, w warunkach in vivo, do rekonstrukcji określonej tkanki – nawet w sytuacji, gdy stan końcowego zróżnicowania tkanki uniemożliwia dalszy podział jej komórek.
Wyróżniamy cztery główne rodzaje komórek macierzystych: zarodkowe (pobrane z ludzkich zarodków), płodowe (z płodów poaborcyjnych), pępowinowe (z krwi pępowinowej) oraz dojrzałe (pobrane z dojrzałej tkanki).
Rozwój komórek macierzystych zachodzi po ich ekspozycji na działanie morfogenu (substancji, która wpływa na przyszły los komórki oraz wywiera na nią różny skutek w zależności od swego stężenia). Dopiero wówczas można określi, w którą z czterech podstawowych typów tkanek przemienią się komórki macierzyste – w nabłonkową, nerwową, łączną czy mięśniową.
11. Fibroblast:
Jest to rodzaj komórki macierzystej występującej u zwierząt, pochodzącej z mezodermy, wydzielającej włókna i macierz tkanki łącznej (ECM – patrz punkt 5, 6). Posiada zwykle rozgałęzioną cytoplazmę oplatającą eliptyczne jądro komórkowe. Aktywne fibroblasty mogą być rozpoznawane dzięki obecności szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. Nieaktywne fibroblasty, zwane fibrocytami, są mniejsze i wrzecionowate, ze zredukowanym retikulum.
Fibroblasty maja zastosowanie w produkcji takich związków jak kolagen, elastyna, glikozaminy, glikoproteiny oraz w procesie otrzymywania ECM.
12. Komórki mięśniowe:
Są to komórki tworzące zespoły, tzw. miocyty – posiadające zdolność do aktywnego kurczenia się, które są z kolei głównym składnikiem tkanki mięśniowej. Wyróżniamy trzy rodzaje tkanki mięśniowej:
§ Gładka – działająca niezależnie od woli i świadomości człowieka, mająca zdolność do ciągłego lecz bardzo powolnego kurczenia się.
§ Poprzecznie prążkowana szkieletowa – zbudowana z wielojądrzastych komórek nazywanych włóknami mięśniowymi, mających charakter syncytium. Tkanka ta posiada niezwykle dużą liczbę mitochondriów i charakterystyczne prążki wywołane obecnością miofilamentów aktynowo-miozynowych (biorących udział w zależnym od naszej woli skurczu włókien mięśniowych).
§ Poprzecznie prążkowana serca – będąca swego rodzaju połączeniem dwóch poprzednich rodzajów. Budową przypomina mięsień poprzecznie prążkowany lecz niewielkie różnice w budowie komórek pozwalają na prowadzenie ciągłej aktywności (ciągłej pracy mięśnia). Mięśnie te działają niezależnie od naszej woli.
13. Zamrażanie komórek:
...
14. Liza komórek, powody uzyskiwania lizatów:
Liza jest to proces rozpadu komórek; lizat natomiast produkt lizy komórkowej. Do lizy komórki może doprowadzić działanie takich czynników jak detergenty, enzymy lityczne czy wirusy.
Po otrzymaniu lizat należy ultrawirować, co spowoduje jego rozdział na frakcje – w zależności od ciężaru poszczególnych substancji składowych komórki. Na dnie probówki znajdą się białka, następnie kwasy nukleinowe i kolejno sacharydy. Fragmenty lipidowe znajdą się w górnej części odwirowanego lizatu.
15. Badania z wykorzystaniem lizatów, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z detergentem (SDS PAGE):
Badania te wykorzystują zjawisko przemieszczania się cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym, w którym nośnikiem jest żel (agaroza, poliakrylamid). SDS (dodecylosiarczan VI sodu) jest detergentem anionowym, który powoduje denaturację i przekształcenie białka w anion, w efekcie wszystkie białka mają liniowy kształt oraz ładunek ujemny, a szybkość ich migracji w żelu zależy wyłącznie od ich wielkości (im większy jon tym wolniej porusza się w polu elektrycznym). Białka są bezbarwne, dlatego stosuje się barwienie błękitem kumasyny lub związkami srebra.
ephedra