1. Definicja pojęć: mikrobiologia, drobnoustrój, hodowla drobnoustrojów, pożywka mikrobiologiczna.
Mikrobiologia – jest nauką o drobnoustrojach (mikroorganizmach). Termin mikrobiologia wywodzi się o terminu greckiego: mikros – mały, bios – życie, logos – słowo. Nauka ta zajmuje się cechami morfologicznymi, właściwościami biochemicznymi, rolą w środowisku naturalnym, właściwościami chorobotwórczymi, jak również zastosowaniem drobnoustrojów w przemyśle.
Drobnoustrój – stanowi odmienna grupę mikroorganizmów pod względem przynależności taksonomicznej, wielkości i budowy. Zaliczamy do nich również wirusy, nie wykazujące zdolności do samodzielnego życia, organizacji komórkowej oraz własnego metabolizmu.
Hodowla drobnoustrojów – Kultura - zespół osobników żyjących w tym samym środowisku w laboratorium.
- czyste-zbiór osobników jednego gatunku wyrosłych na jednym podłożu
- mieszane-w skład hodowli wchodzą osobniki różnych gatunków na jednym podłożu
- płynne- w probówkach, kolbach, fermentatorach
-stałe-na skosach, słupkach, płytkach
-okresowe- drobnoustroje wprowadzane do pożywki rozwijają się w niej do momentu wyczerpania składników odżywczych lub śmierci komórki w wyniku zatrucia własnymi produktami metabolicznymi
-otwarte(ciągłe)-w trakcie kontrolujemy zużycie substancji odżywczych, przyrost biomasy lub stężenie produktów przemiany materii
-synchronizowane-większość komórek dzieli się równocześnie, populacja podlega takim samym zmianom w czasie
Pożywka mikrobiologiczna (podłoże)– środowisko, w którym sztucznie stworzono warunki odżywcze dla rozwoju bakterii. Wyróżniamy:
- pożywki płynne – bulion odżywczy
- pożywki zestalone (niepłynne) – zestalone agarem (ok.3%) -uniwersalny zestalacz, otrzymywany z morskich krasnorostów, nie jest rozkładany przez większość mikroorganizmów, krzepnie w temp. 45 st.C
- skos agarowy (bulion + 3% agaru)
- płytki agarowe (bulion +agar)
2. Różnice pomiędzy Pro – i Eukaryota.
Procaryota to bakterie, sinice, bakterie właściwe, archebakterie. Słabo wykształcona struktura komórek. Brak jądra otoczonego błoną jądrową i jąderka oraz białek pistonowych, funkcje jądra spełnia nukleoid (ziarno jądrowe) – podwójna nić DNA będąca jednym chromosomem (bakteryjnym) styka się bezpośrednio z cytoplazmą. Brak w tych komórkach lizosomów, mikrosomów i mitochondriów. Udział w procesach utleniania biologicznego i gromadzenia energii w ATP pełnią mezosomy będące wpukleniami błony cytoplazmatycznej do wnętrza komórki. Nie występuje siateczka endoplazmatyczna. Poza mykoplazmami, które nie mają ściany komórkowej wszystkie Procaryota posiadają ją. Występuje w niej polimer mureina. Rybosomy cytoplazmatyczne tworzą zgrupowania zwane polirybosomami. Wytwarzają formy przetrwalne. Rozmnażają się przez prosty podział poprzeczny.
Eucaryota to glony, grzyby strzępkowe, pierwotniaki. Podstawową cechą jest wyodrębnione i wyraźnie zróżnicowane jądro (nucleus) o wielu chromosomach. Otoczone jest błoną jądrową, ma jąderko i zawiera białka histonowe. Błona cytoplazmatyczna łączy się z systemem błon tworzących sieć w cytoplazmie. Jest to siateczka endoplazmatyczna. Dzieli ona cytoplazmę na wiele odrębnych przestrzeni – kompartmentów. Na siateczce rozmieszczone są rybosomy. W cytoplazmie występują lizosomy, mikrosomy, mitochondria. Mitochondria otoczone są podwójną błoną, zawierają własny, odrębny DNA i rybosomy. W mitochondriach zachodzą procesy oddychanie komórkowego komórkowego gromadzenie energii w ATP. Ściana komórkowa ma prostszą budowę i nie występuje u wszystkich tych drobnoustrojów. Nie zawiera mureiny. Jeśli komórki eukariotyczne nie mają ściany komórkowej to osłonięte są błoną cytoplazmatyczną.
Cechą wspólna jest syntez białek z udziałem RNA i rybosomów oraz uniwersalny kod genetyczny.
Wirusów nie możemy zaliczyć do żadnej z grup gdyż nie mają struktury ani organizacji komórkowej.
3. Jak badamy drobnoustroje?
Diagnostyka mikrobiologiczna -zespół czynności mających na celu identyfikację drobnoustrojów występujących w badanym materiale biologicznym, zmierza do ustalenia przynależności gatunkowej tych drobnoustrojów.
Etap wstępny diagnostyki-przygotowujemy preparat przyżyciowy lub utrwalony oraz badania właściwe:
- wyosobnienie interesujących nas drobnoustrojów z badanego materiału
-uzyskanie hodowli czystych
-ocena ich morfologicznych cech (makro i mikroskopowo)
-ocena właściwości fizjologicznych i biochemicznych
-właściwości chemolityczne i biologiczne
- stosowanie testów serologicznych
-ocena wrażliwości na antybiotyki
4. Barwienie bakterii; metoda Gramma – mechanizm i wykorzystanie w praktyce.
Barwienie preparatu:
-pozytywne-wybarwiony drobnoustr., tło jest jasne niezabarwione
-negatywne-wybarwione tło; barwienie nigrozyną w celu uwidocznienia otoczek;
-proste-jeden barwnik przez określony czas,
-złożone-kilka barwników, które są w mieszaninie lub w ściśle określonej kolejności
Mechanizm barwienia metodą Grama
Jest to metoda złożona i różnicująca. Pozwala podzielić drobnoustroje na Gramdodatnie i Gramujemne. Ma znaczenie w diagnostyce.
Proces barwienia: - Zalać szkiełko świeżo przesączonym roztworem Gencjany (fiolet krystaliczny z dodatkiem fenolu – 2 min), - spłucz barwnik wodą, - nalej na preparat płyn Lugola (roztwór J w KJ – 1 min), - ponownie spłucz wodą, - odbarwiaj preparat Alkoholem (etanol z acetonem – 20 sek.), nalej roztwór fuksyny 1:10 (alkoholowo – wodny roztwór fuksyny zasadowej – 20 sek.), spłukany wodą preparat wysusz odciskając go w bibule, - oglądać pod immersją. Wynik: gramdodatnie – fioletowoniebieskie, gramujemne – różowe.
W wyniku działania fioletu krystalicznego i płunu Lugola powstaje w komórce kompleks tego barwnika z jodem. Kompleks ten u b.gramujemnych jest usuwany w wyniku ekstrakcji alkoholem etylowym, u gramdodatnich nie i pozostaje w komórkach – spowodowane jest to działaniem alkoholu na komórki bakterii o różnej budowie ściany komórkowej.
Gram-dodatnie : Micrococcus (ziarenkowiec pojedynczy), Streptococcus (paciorkowiec), Sarcina(rakietowiec), Bacillus subtilis (laseczka) – ściana komórkowa zbudowana jest z wielu warstw peptydoglikanu, który odwodniony działaniem etanolu zostaje uszczelniony. Alkohol działając na wiele warstw peptydoglikanu, u tych bakterii, powoduje wytracanie jego szkieletu cukrowego oraz denaturacje tetra (penta) peptydów i mostków peptydowych. Wynik tego działania to trwałe zamknięcie się porów pomiędzy poszczególnymi warstwami mureny i w następstwie tego zatrzymanie kompleksu jodu z fioletem krystalicznym w komórce.
Gram-ujemne: Staphylococcus(gronkowiec), Rhodospirillum(śrubowiec), Escherichia coli(pałeczka) – stwierdzono obecność jednej, a w niektórych miejscach komórki do trzech warstw peptydoglikanu. Potraktowanie etanolem tak cienkiej warstwy mureiny w tych komórkach nie jest wystarczające, aby wspomniany kompleks fioletu z jodem mógł pozostać, szczególnie wtedy gdy po zadziałaniu alkoholem, zewnętrzna warstwa plastyczna ściany komórkowej tych bakterii, tzw. błona zewnętrza komórki zostaje zniszczona na skutek ekstrakcji z niej fosfolipidów. Prowadzi to do wypłukania warstwy plastycznej ściany z komórki, a w konsekwencji do wymycia z niej wspomniano kompleksu i zabarwienie jej po potraktowaniu fuksyną na kolor różowy.
5. Podstawowe elementy ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych i ich znaczenie biologiczne.
O wyniku barwienia metodą Grama decyduje grubość warstwy mureiny (peptydoglikanu) w ścianie komórkowej. Warstwa mureiny bakterii Gram-dodatnich jest o wiele grubsza niż u Gram-ujemnych. Fiolet krystaliczny penetruje do wnętrza komórki i łącząc się z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany do odbarwiania preparatu, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii Gram-dodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii Gram-ujemnych. Powoduje on również odwodnienie mureiny, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Gruba, sztywna warstwa mureiny bakterii Gram-dodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym, który przez cienką warstwę mureiny bakterii Gram-ujemnych wydostaje się na zewnątrz komórki. Fuksyna lub safranina jako barwnik kontrastowy zabarwia bakterie Gram-ujemne na czerwono.
Ściana komórkowa bakterii Gram-dodatnich zbudowana jest z mureiny i kwasów tejchojowych. Mureina jest tu wielowarstwowa i może stanowić do 90% materiału ściany komórkowej. Kwasy tejchojowe są polimerami składającymi się z powtarzających się jednostek glicerolu lub rybitolu, połączonych wiązaniem fosfodiestrowym. Są one powiązane z mureiną lub błoną cytoplazmatyczną za pomocą wiązań kowalencyjnych. U niektórych bakterii Gram-dodatnich ze ścianą komórkową związane są specyficzne białka pełniące rolę komórkowych czynników chorobotwórczych. Są to białka: białka A, np. gronkowiec złocisty, białko B – paciorkowiec ropotwórczy. Oba te białka utrudniają fagocytozę. Brak jest lipopolisacharydów (LPS) i lipidów (za wyjątkiem bakterii kwasoopornych).
Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych ma budowę znacznie bardziej złożona. Jest zbudowana z kilku warstw mureiny, lipoproteiny i błony zewnętrznej. Mureina składa się tylko z jednej do trzech warstw, co stanowi 5-20% materiału ściany komórkowej. Jest ukryta w przestrzeni peryplazmatycznej, pod błoną zewnętrzną. Lipoproteina wiąże błonę zewnętrzną z mureiną. Błona zewnętrzna składa się z fosfolipidów i lipopolisacharydu (LPS). Brak kwasów tejchojowych.
6. Otoczki bakteryjne, budowa i znaczenie dla bakterii.
Niektóre bakterie wytwarzają na zewnętrznej stronie ściany komórkowej przepuszczalną osłonę o różnym składzie chemicznym, zwaną śluzem powierzchniowym lub otoczką. Śluz ten nie jest trwale związany z komórką i może być spłukany wodą. Jest to bardzo cienka osłona, której nie widać przez mikroskop i można ją wykryć tylko metodami serologicznymi. Otoczka właściwa jest większa od komórki bakteryjnej, trwale związana z komórką. Pod względem chemicznym otoczki dzielimy na polipeptydowe (białkowe), wielocukrowe oraz o strukturze złożonej (np. białkowo-cukrowe, cukrowo-lipidowe).
Funkcje:
Otoczki są najważniejszym czynnikiem chroniącym bakterie przed wysychaniem w środowisku naturalnym. Występowanie otoczek ma wpływ na transport komórkowy. Niektóre bakterie syntetyzujące otoczki są bardziej odporne na działanie antybiotyków, których przenikanie do wnętrza komórki jest utrudnione. Otoczki mogą również wiązać jony metali ciężkich, jak również kationy pierwiastków potrzebnych do metabolizmu. Otoczka chroni też przed działaniem obronnym zakażonego organizmu człowieka lub zwierzęcia. Prowokuje organizm zakażony do wytwarzania przeciwciał. Niektóre bakterie upodabniają antygeny do naszego organizmu (mimikra).
Niektóre bakterie wytwarzają warstwę ,,S’’ = surface (powierzchnia) – dodatkowa osłona komórki, występuje najczęściej u archebakterii, zbudowana z białka.
7. Rzęski i fimbrie u bakterii oraz ich znaczenie
Rzęski – wytwarzane przez wiele grup bakterii, odpowiedzialna za ich ruch w środowisku wilgotnym. Chylindryczne, nitkowate wypustki o długości 5-20µm i średnicy 12-20 µm, zaczepione w błonie cytoplazmatycznej i zbudowane z kurczliwego białka zwanego flageliną. Typy urzęsienia:
· monotrichalne
· amfitrichalne
· lofotrichalne
· peritrichalne
Rzęski są immunogenne, a przeciwciała antyrzęskowe są stosowane w diagnostyce lekarskiej do klasyfikacji serologicznej bakterii z rodzaju Enteriobacteriaceae. Rzęska składa się z:
· nici (włókna) – 98% rzęski
· haka – połączenie
· ciała podstawowego (bazalnego)
Bakterie posiadające rzęski mogą łatwiej zmieniać nisze ekologiczne w środowisku naturalnym.
Fimbrie – białkowe, nitkowate „wyrostki” bakterii, bardziej sztywne niż rzęski, o długości o,5-2 µm i średnicy 0,2 µm. Dwie grupy:
· fimbrie pospolite – ich synteza jest determinowana przez nukleoid bakteryjny. Odpowiedzialne za odherencje, charakteryzują się zdolnością do zlepiania krwinek (zjawisko hemaglutynacji)
· fimbrie płciowe – kodowanie przez plazmidy. Warunkują proces koagulacji u bakterii.
8. NUKLEOID Bakteryjny (Genofor, Chromosom bakteryjny) - obszar cytoplazmy komórek prokariotycznych, w którym znajduje się kolista nić kwasu deoksyrobonukleinowego nie oddzielonego żadną błoną od pozostałych elementów tej komórki (dlatego określanie nukleoidu, jako jądra komórkowego jest niepoprawne). Budowa przestrzenna DNA – konformacja- może przyjmować różne kształty: kolisty, zre...., czasteczka ulega superskręceniu. Budowa domenowa DNA zakłada, że cząsteczka DNA składa się z domeny (fragmentów) ok. 40 kilku domen. Domeny różnią się kofiguracją przestrzenną. Zmiana domen, oddziaływanie z białkami histonowymi to funkcja nukleoidu
9. Przetrwalniki u bakterii – budowa i znaczenie. Tworzenie przetrwalników charakterystyczne jest dla wielu grup drobnoustrojów, głownie dla bakterii Gram-Dodatnich. Przetrwalniki (tzw. Endospory) powstają wewnątrz komórek wegetatywnych, najczęsciej w niesprzyjających warunkach (brak wody, substancji odżywczych, podwyższona temperatura itp.) Spory mogą być ułożone w komórce centralnie lub przybiegunowo, przy czym u laseczek tlenowychkomórki zawierające endospory zachowują wielkość i kształt, natomiast u laseczek beztlenowych często obserwujemy rozdęcie komórki w miejscu występowania przetrwalnika u rodzajów : Bacillus i Clostridium. Rhodomicrobium vannielii – w cyklu rozowojowym na zewnątrz komórek macierzystych wywarzane są egzospory. Powstawanie przetrwalników (sporulacja) jest procesem złożonym, wieloetapowym. Dojrzała endospora jest otoczona kilkoma osłonkami – błaną komórkową, ścianą, korą, błoną zewnętrzną, kilkuwarstwową okrywą, egzosporium.
budowa przetrwalników, a także ich skład chemiczny powodują, iż są one oporne na wysuszenie, wysoką i niską temperaturę, promieniowanie uv, brak pokarmu, a także inne czynniki fizyczne i chemiczne. Bakterie wytwarzające przetrwalniki odgrywają bardzo ważną rolę w biotechnologii. Drobnoustroje z rodzaju bacillus wytwarzają wiele enzymów wykorzystywanych w przemyśle spożywczym oraz przy produkcji antybiotyków. Laseczki tlenowe syntetyzują również antybiotyki polipeptydowe, a także bioinsektycydy, tj. białka wykazujące działanie przeciwko owadom. Bakterie z rodzaju Clostridium wykorzystywane są do procesów fermentacji skrobii, celulozy i pektyn. Bakterie te odgrywają ważną rolę w procesach oczyszczania ścieków i odpadów.
10. Metabolizm, anabolizm, katabolizm, amfibolizm
METABOLIZM drobnoustrojów- pozyskiwanie substancji i wytwarzanie energii. Metabolizm dzielimy: na katabolizm- reakcja rozkładu do zwiazków prostych z wydzieleniem energii oraz anabolizm- ze zwiazków prostych na drodze biosyntezy tworzone związki złożone.
ANABOLIZM- szlag metaboliczny, który zaczyna się i przebiega do momentu rozkładu, proces ten zatrzymuje się i te proste związki chemiczne od razu komórka wykorzystuje do reakcji biosyntezy.
11. Wymagania odżywcze drobnoustrojów- żródło węgla i energii, żródło(donator) elektronów i protonów, źródło azotu.
Podział drobnoustrojów ze wzgl na wykorzystywane żródła energii:
Źródła węgla( wykorzystywany CO2, CO) rośliny, glony asymilują CO2- czyli autotrofy i grypa taka, która musi korzystać ze zwiazków organicznych- heterotrofy.
Autotrofy- asymilacja co2 to przekształcenie CO2.
Jeśli jest proces redukcji to wymaga on nakładu energetycznego i mamy dwa żródła energii: promienista i chemiczna. Te organizmy, które korzystają z energii promienistej to fototrofy a z energii chemicznej- chemotrofy.
Reakcja redukcji- przyłączenie protonów i elektronów i musimy mieć dawcę: związki nieorganiczne. I takie organizmy , które korzystają ze związków nieorganicznych – litotrofy a , które korzystają z organicznych to organotrofy. HETEROTROFY- nie mogą korzystać z CO2, nie prowadzą fotosyntezy, hemosyntezy. Muszą mieć w pożywce gotowe związki organiczne. Heterotrofy dzielimy na : prototrofy - żyja na ubogich pożywkach i auksotrofy- nie mogą życ na ubogich pożywkach( dodatkowo oprócz glukozy wymagają czynników wzrostowych).
12. TRZY FORMY ODDYCHANIA (przenoszenia energii)
- oddychanie tlenowe- ostatecznym akceptorem jest tlen
- oddychanie beztlenowe- ostatecznym akceptorem jest związek nieorganiczny
- fermentacja- akceptorem ostat zwiazek organiczny
oddychanie- proces utleniania biologicznego.
Najwięcej energii mamy z wykorzystania cukrów, cukry- materiał energetyczny. W środ naturalnym są cukry złożone. Bakterie, żeby wykorzystać te cukry muszą posiadać odpowiednie enzymy(np. amylaza w przypadku skrobi)
Niezależnie od rodzaju oddychania część przemian glukozy jest wspólna. Są trzy szlaki chemiczne:szlak glikolizy EMP, szlak pentozowy, szlak ED.
Cykl pentozowy- glukoza przekształca się do rybozy , pentozy. Pentozy wykorzystywane są do syntezy kwasów nukleinowych.
- szlak kataboliczny i amfoboliczny
W oddychaniu tlenowym po glikolizie jest cykl Krebsa czuli
utlenianie biologiczne w warunkach tlenowych. Cykl krebsa współpracuje z łańcuchem oddechowym. Ostatecznym akceptorem jest tlen. W efekcie oddychania pojawi się woda, ATP, CO2. protony i elektrony przenoszone na tlen.
ODDYCHANIE BEZTLENOWE- np. oddychanie azotanowe- glukoza może być utleniana w glikolizie i w cyklu krebsa, protony i elektrony i nie ma przenoszenia na tlen. Przenoszenie protonów i elektronów może być na azotany, azotyny lub hydroksyloaminy. E. coli może korzystać z oddychania tlenowego a wnaszym organizmie posługiwać się oddychaniem azotanowym.
FERMENTACJA- oddychanie – zjawisko utleniania biologicznego i przenoszenie protonów i elektronów na zwiazki organiczne.
HOMOFERMENTACJA- oddychanie biologiczne jak skończy się powstaje jeden produkt.
HETEROFERMENTACJA- przemiany , powstaja dwa związki chemiczne (fermentacja bakterii jelitowych, fermentacja mlekowa- powsaje kwas mlekowy i atanol)
13. Główne szlaki przemian cukrowców.
Szlak EMP (glikoliza)-na drodze fosforylacji substratowej powstają dwie reszty ATP oraz dwie cząsteczki NADH+H+, co prowadzi do wytworzenia z jednej reszty glukozy 2 cząsteczek kwasu pirogronowego. Jego dalsze przemiany przebiegają odmiennie w różnych warunkach wzrostu drobnoustrojów-tlenowych lub beztlenowych. Glikogen, skrobia, celuloza (cukry złożone) rozkładane do cukrów prostych-> glukoza; przejście ATP w ADP -> fruktozo-1,6-difosforan-> dihydroksyaceton lub aldehyd 3-fosfoglicerynowy (to samo dla jednego i drugiego związku); przejście NAD+ w NADAH +H+-> kwas difosfoglicerynowy; przejście ADP w ATP-> kwas pirogronowy.
Cykl pentozowy (HMP)-spełnia 2 funkcje:- jest szlakiem dysymilacyjnym pozwalającym na spalenie glukozy z wytworzeniem 12 moli NADH+H+, odpowiadających 36 cząsteczkom ATP; cykl ten jest szlakiem amfibolicznym, dostarczającym reszty NADPH+H+, które podobnie jak metabolity pośrednie: fruktozo-6-fosforan, rybozo-5-fosforan, erytrozo-4-fosforan potrzebne są do biosyntezy polisacharydów, nukleotydów i aminokwasów aromatycznych. Glukoza-> glukozo-6-fosforan; przejście NADP+ w NADPH+H+-> kwas 6-fosfoglukonowy; przejście NADP+ w NADPH+H+ i wydzielenie CO2->rybulozo-5-fosforan:
-> ksylulozo-5-fosfpran po licznych przemianach ->fruktozo-6-fosforan
->rybozo-5-fosforan po licznych przemianach -> fruktozo-6-fosforan
->rybulozo-5-fosforan po licznych przemianach-> aldehyd 3-fosforlicerynowy.
Szlak Entnera-Doudorffa-w mniejszym stopniu rozpowszechniony wśród drobnoustr. Funkcjonuje u Pseudomonas, Acetobacter, Xantomanas, Gluconobacter. Może dostarczać pośredników do biosyntezy nukleotydów lub spełniać funkcje procesów prowadzących do degradacji glukozy, ale z badrzo małym zyskiem energ...
holubeczek