kinetyka reakcji enzymatycznych I.docx

Biochemia

laboratorium

Ćwiczenie 5:

Kinetyka reakcji enzymatycznych (część I)

Wpływ pH, temperatury, aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznych

Sprawozdanie poprawione 13.05.2011

grupa:

Katarzyna Kędzierska  144530

Dominika Kępska

Justyna Dabrowska

kierunek Biotechnologia

grupa dziekańska: III

semestr: IV

data wykonania ćwiczenia: 5.05.201

data oddania sprawozdania 16.05.2011
 

I.       Wstęp teoretyczny:

Enzymy – są to wielkocząsteczkowe związki chemiczne, głównie białkowe. Ich podstawową funkcją jest katalizowanie (przyspieszanie) reakcji chemicznych, poprzez obniżenie ich energii aktywacji.

Zmiany energii w czasie reakcji. By przeprowadzić substraty (S) w stan przejściowy (S*) potrzeba dużej energii do pokonania progu aktywacji. Składniki reakcji w stanie przejściowym są konwertowane następnie w produkty końcowe (P). Enzym obniża energię aktywacji reakcji poprzez utworzenie alternatywnej ścieżki reakcji ze stanem pośrednim (ES*) o mniejszej energii oraz stabilizują go poprzez jego specyficzne wiązanie. Zmniejszenie energii aktywacji zwiększa szybkość reakcji.
Większość reakcji biochemicznych zachodziłaby znacznie wolniej bez katalitycznego działania enzymów. Enzymy są swoistymi katalizatorami danych reakcji, co oznacza, że w przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych (H+, OH-, jonów metali), każdy enzym katalizuje niewielką liczbę reakcji, a często tylko jedną. Zasadniczo wszystkie reakcje biochemiczne są katalizowane przez enzymy, co potwierdza ogromne znaczenie, jakie odgrywają te substancje. Enzymy przyspieszają reakcje chemiczne, lecz o szybkości reakcji nie decyduje jedynie stężenie enzymu i substratu.
Na działanie enzymów mają wpływ różne czynniki:

·         stężenie jonów wodorowych (pH)

·         temperatura reakcji

·         niekiedy potencjał redukcyjno – oksydacyjny środowiska, w którym zachodzi reakcja

·         obecność różnych związków niskocząsteczkowych (koenzymów, aktywatorów, inhibitorów)

·         siła jonowa

·         stała dielektryczna środowiska.
 

II.  Część doświadczalna:
 

1.     Wpływ pH na aktywność α-amylazy:
 

a)      Wykonanie:
Do 6 probówek odmierzyliśmy po 1 cm3 roztworów buforowych o pH: 3, 4, 5, 6, 7 i 8. Do każdego z odmierzonych roztworów buforowych dodaliśmy pipetą po 2 cm3 koloidalnego roztworu skrobi. W międzyczasie przygotowaliśmy płytki porcelanowe z zagłębieniami, do których wprowadziliśmy po 2 krople roztworu jodu w jodku potasu. Do zbuforowanych roztworów skrobi, dodawaliśmy pipetą w równych odstępach czasu (co 15 sekund) po 1 cm3 roztworu α-amylazy, a następnie całość natychmiast mieszaliśmy. Przy pomocy pipet pasterowskich pobieraliśmy w równych odstępach czasu (co 15 sekund) próby każdego z hydrolizatów, przenosząc je na płytki z roztworem jodu w jodku potasu. Obserwowaliśmy powstające na płytkach zabarwienie, wskazujące na stopień rozkładu skrobi w danej próbce. Pobieranie prób hydrolizatów przerwaliśmy w momencie, gdy jedna z prób w reakcji z jodem w jodku potasu zabarwiła się na jasnobrunatny (herbaciany) kolor. W tym momencie poczynając od pierwszej probówki, w równych odstępach czasu, dodawaliśmy pipetą do wszystkich 6 hydrolizatów po 2 krople roztworu jodu w jodku potasu. Natychmiast wymieszaliśmy zawartość probówek i zaobserwowaliśmy powstające zmiany.



 

b)     Obserwacje:
Tabela nr 1: Obserwacje zabarwienia produktów hydrolizy skrobi w reakcji z jodem w jodku potasu i wnioski dotyczące stopnia hydrolizy skrobi

c)      Wnioski:
Z doświadczenia wnioskujemy, że optymalne pH, enzymu α-amylazy,  to pH = 5. Potwierdza to fakt, że α-amylaza przy pH = 5 osiągnęła maksymalną aktywność (miała najlepsze działanie katalityczne), gdyż przy takim właśnie pH, w tym samym czasie, reakcja hydrolizy skrobi zaszła najdalej (skrobia została rozłożona do  glukozy, maltozy, oligocukrów redukujących i achrodekstryn – związków nie barwiących się jodem). W innych probówkach otrzymaliśmy barwne roztwory, gdyż znajdowały się w nich inne substancje rozkładu skrobi, takie jak amylodekstryny, erytrodekstryny i sama nierozłożona skrobia, barwiące się z jodem. Oznacza to, że w tym samym czasie, w innym pH niż pH optymalne, reakcja przebiegała wolniej. α-amylaza miała słabsze działanie katalityczne dla reakcji hydrolizy skrobi, co wskazuje na to, że jej aktywność była niższa od jej maksymalnej aktywności uzyskanej w optymalnym pH. Zatem, aby reakcja katalizowana przez enzym białkowy przebiegała najszybciej (najbardziej efektywnie) należy ją przeprowadzać w pH optymalnym.
Na aktywność enzymu α-amylazy, jak i na aktywność każdego innego enzymu, pH ma ogromny wpływ, ponieważ enzymy mają składnik białkowy. W zależności od stężenia jonów wodorowych, zmienia się stan jonowy białek, które przyjmują postać elektrododatniego kationu (w pH<pI), elektroobojętnego amfijonu (w pH=pI) bądź elektroujemnego anionu (w pH>pI). Z kolei ładunek cząsteczki białka enzymatycznego wpływa na działanie katalityczne enzymu, czyli na jego aktywność.
 

2.     Wpływ temperatury na aktywność α-amylazy:
 

a)      Wykonanie:
Do 2 probówek odmierzyliśmy po 1 cm3 koloidalnego roztworu skrobi i po 0,5 cm3 buforu o pH optymalnym (czyli pH=5) dla działania badanego preparatu
α-amylazy. Inkubowaliśmy każdą z probówek w ciągu 5 minut w łaźni wodnej utrzymującej temperaturę 50ºC. Równocześnie inne grupy laboratoryjne przeprowadzały analogiczne zadanie, ale używały łaźni wodnych utrzymujących inne temperatury (40, 60, 70, 80 ºC) lub inkubowały próbki w temperaturze pokojowej, na stole laboratoryjnym. Po 5 minutach do każdej probówki dodaliśmy po 0,5 cm3 roztworu α-amylazy. Natychmiast dokładnie wymieszaliśmy zawartość probówek i inkubowaliśmy je dalej w temperaturze 50ºC (inne grupy laboratoryjne w pozostałych temperaturach) przez kolejne 3 minuty.  Dokładnie po upływie tego czasu, pobraliśmy 0,5 cm3 mieszaniny reakcyjnej i wprowadziliśmy do uprzednio przygotowanej probówki zawierającej 0,5 cm3 roztworu DNS. Wymieszaliśmy i umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Następnie schłodziliśmy probówki i dodaliśmy 4 cm3 wody destylowanej. Wymieszaliśmy ponownie i zmierzyliśmy absorbancję roztworu przy długości fali równej 540 nm wobec próby odczynnikowej, zawierającej 0,5 cm3 wody destylowanej zamiast mieszaniny reakcyjnej. Równocześnie inne grupy laboratoryjne zmierzyły absorbancję swoich roztworów (inkubowanych w innych temperaturach).
 

b)     Obserwacje i obliczenia:
Obliczenia dla uzyskanych wartości absorbancji: 0,535 i 0,543 dla fali długości λ=540 nm w zadanej temperaturze 50ºC:
Z krzywej wzorcowej A540 = f(cmaltozy): 0,1 – 0,2 mg maltozy/cm3
(Oznacza to, że w badanym roztworze o absorbancji A540 = 0,1, stężenie cukrów redukujących w przeliczeniu na maltozę wynosi: 0,2 mg maltozy/cm3)
                                        0,535 – x mg maltozy/cm3
                                        0,543 – y mg maltozy/cm3
                                        x = 1,070 mg maltozy/cm3
                                        y = 1,086 mg maltozy/cm3
Tabela nr 2: Zmierzone wielkości absorbancji hydrolizatów inkubowanych w różnych temperaturach, oraz wyliczone stężenia cukrów redukujących [mg maltozy/cm3]