Lab 4 - Kataliza enzymatyczna oksydazy, katalaza, peroksydazy - instrukcja.pdf

(29 KB) Pobierz
I_Kataliza enzymatyczna
Kataliza enzymatyczna: oksydazy, katalaza, peroksydazy
Biochemiczne reakcje oksydoredukcyjne są podstawowymi procesami
dostarczającymi energii niezbędnej dla przemian w organizmach Ŝywych. Poszczególne
ogniwa utleniania biologicznego są katalizowane przez róŜnorodne enzymy. Końcowy etap
utlenienia zachodzi w łańcuchu oddechowym.
1. Oksydazy
Enzymy te przenoszą wodór bezpośrednio na tlen atmosferyczny. Substratami są
często mono- i polifenole. Spośród oksydaz duŜe znaczenie praktyczne ma oksydoreduktaza
o-dwufenol: tlen (EC 1.10. 3.1) zwana potocznie oksydazą fenolową, oksydazą o-
dwufenolową, oksydazą polifenolową (wielofenolową), tyrozydazą lub katecholazą. Enzym
ten jest metaloproteidem zawierającym w swoim składzie miedź (ok. 0,2%), która przyjmuje
elektrony od fenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. W wyniku działania enzymu o-
dwufenol przekształca się w o-chinon, a w wyniku dalszej kondensacji chinonów powstają
ciemno zabarwione produkty. Działaniu enzymu ulega równieŜ fenol jednowodorotlenowy,
przy czym tworzy się najpierw pirokatechina. Oksydaza fenolowa odgrywa duŜą rolę w
przemyśle spoŜywczym. Dzięki jej działaniu następuje ciemnienie przekroju rozciętego jabłka
lub ziemniaka, efektem jej działania jest takŜe kolor czarnej herbaty, chleba razowego, a zbyt
duŜa jej aktywność moŜe spowodować ciemnienie makaronu w czasie suszenia.
Sprzęt i odczynniki
- wyciąg ziemniaczany (ziemniaki, nóŜ, tarka, płótno, zlewka),
- 1% roztwór fenolu,
- 1% roztwór pirokatechiny,
- 1% roztwór pirogallolu,
- statyw z probówkami, pipety.
Wykonanie do ś wiadczenia
Przygotować wyciąg ziemniaczany przez umycie i obranie ziemniaka, utarcie na tarce
i włoŜenie do woreczka płóciennego, a następnie zanurzenie w zlewce z około 200 ml wody.
Zawartość zlewki łagodnie mieszać. Uzyskuje się wodny ekstrakt enzymów i skrobii; po
odwirowaniu przy niskich obrotach, ciecz nadosadową naleŜy zdekantować i uŜywać do
doświadczeń.
Do probówek wlać po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Dodać do pierwszej probówki
10 kropli 1% fenolu, do drugiej - 10 kropli 1% pirokatechiny, a do trzeciej - 10 kropli
roztworu pirogallolu. Zawartości probówek zamieszać i obserwować zmiany zabarwienia.
PoniewaŜ reakcja zachodzi dość długo, w międzyczasie naleŜy wykonać pozostałe
doświadczenia.
Wyniki doświadczeń
Notować w określonych odstępach czasu nasilenie barwy w probówkach
zawierających poszczególne fenole.
1
167137942.004.png
Intensywność barwy
Probówka
Czas
15 min.
30 min.
45 min.
60 min.
1. Z fenolem
2. Z pirokatechiną
3. Z pirogallolem
2. Katalaza
Katalaza (1.11.1.6) jest nadzwyczaj szeroko rozpowszechnionym enzymem;
występuje u zwierząt, roślin i wszystkich bakterii tlenowych. Katalizuje reakcję rozkładu
nadtlenku wodoru do tlenu i wody według równania:
2
H
2
O
®
2
H
2
O
+
O
2
Katalaza jest metaloproteidem i w stanie krystalicznym zawiera 0,09% Ŝelaza, co
odpowiada czterem atomom Fe na cząsteczkę. Istnieje wiele inhibitorów katalazy. Sam
nadtlenek wodoru w większych stęŜeniach takŜe powoduje inaktywację enzymu. Hamująco
działa szereg substancji reagujących z Ŝelazem trójwartościowym koenzymu katalazy
(cyjanki, siarczki, azydki, fluorki, hydroksyloamina).
Sprzęt i odczynniki
- wyciąg ziemniaczany (z podpunktu 1.),
- 3% H 2 O 2 ,
- statyw z probówkami, pipety.
Wykonanie doświadczenia
Do 5 ml wyciągu ziemniaczanego dodać l ml 3% H 2 O 2 . Pod działaniem katalazy
następuje obfite wydzielanie tlenu.
Powtórzyć doświadczenie po uprzednim ogrzaniu wyciągu ziemniaczanego do
wrzenia (inaktywacja enzymu przez denaturację białka).
Wyniki doświadczeń
Doświadczenie
Wynik
Wniosek
Probówka 1
Probówka 2
3. Peroksydaza
Peroksydaza (EC. 1.11.1.7) jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach;
występuje takŜe u zwierząt i niektórych bakterii. Jej działanie, podobnie jak katalazy
związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Jednak nadtlenek nie jest rozkładany z
wydzieleniem tlenu, ale wykorzystywany jest przez enzym w reakcjach utleniania wielu
substratów - fenoli i amin aromatycznych.
Podobnie jak katalaza, koenzym peroksydazy zawiera Ŝelazo. Jest ona mało wraŜliwa
na wysoką temperaturę i jeszcze w 100°C zachowuje częściowo swoją aktywność.
2
2
167137942.005.png 167137942.006.png 167137942.007.png 167137942.001.png 167137942.002.png
Przebieg typowej reakcji katalizowanej przez peroksydazę wyrazić moŜna przy
pomocy schematu:
AH
+
H
O
¾
peroksydaz
¾
¾
a
®
A
+
2
H
O
2
2
2
2
Sprzęt i odczynniki
- jak w ćwiczeniu 1. i 2.
- 4% roztwór benzydyny w kwasie octowym.
3.1. Próba z fenolami
W przypadku korzystania z tego samego, co w przypadku oksydazy fenolowej, źródła
enzymu (sok ziemniaczany), tworzenie barwnych produktów następuje o wiele szybciej w
obecności nadtlenku wodoru, gdyŜ równocześnie działają oksydazy i peroksydazy.
Wykonanie doświadczenia
Do probówek zawierających po 5 ml wyciągu ziemniaczanego wprowadzić po 10
kropli 1% roztworu fenolu, pirokatechiny i pirogallolu, a następnie po 10 kropli 3% H 2 0 2 ,
Obserwować powstawanie barwy.
3. 2. Próba benzydynowa
Substancja, która moŜe ulec utlenieniu pod wpływem działania peroksydazy w
obecności H 2 O 2 moŜe być benzydyna. Następuje wówczas przeniesienie tlenu z nadtlenku
wodoru na benzydynę i przekształcenie jej w błękit benzydynowy.
Wykonanie doświadczenia
Do 5 ml wyciągu ziemniaczanego dodać kroplę 4% roztworu benzydyny w
CH 3 COOH i kilka kropli 3% H 2 O 2 . Zanotować wyniki.
Opracowanie wyników badań
Podsumować i omówić uzyskane wyniki badań.
3
¾
167137942.003.png

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin