Oksydoreduktazy.doc

Politechnika Łódzka

Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie 8

Oksydoreduktazy

Wydział: BiNoŻ

Kierunek: Biotechnologia

Semestr: IV

Grupa dziekańska: III

Dzień tygodnia: Czwartek 830

Data wykonania ćwiczenia: 19.05.11r.

Szczepaniak Dominik, nr 20

Szewczuk Michał, nr 21

Zabłocki Miłosz, nr 25

Poprawa I

Data oddania: 13.06.11r.

WSTĘP TEORETYCZNY

Oksydoreduktazy – enzymy katalizujące procesy utleniania oraz redukcji substratu. Ich działanie polega na przenoszeniu elektronów i protonów z donora na akceptor, co prowadzi do zmiany stopnia utlenienia zarówno jednego, jak i drugiego związku.

Oksydoreduktazy dzieli się na 5 grup:

- dehydrogenazy

              Katalizują one bezpośrednie odwodorowanie substratu. Ich rolą jest także przenoszenie elektronów i protonów z substratu na koenzym

- reduktazy

              Te enzymy katalizują przenoszenie protonów i elektronów, ewentualnie samych elektronów, pomiędzy przenośnikami

- oksygenazy

              Katalizują przyłączenie tlenu do związku organicznego

              Dzielą się na

·         Oksygenazy właściwe zwane dioksygenazami. Ich zadaniem jest kataliza procesu polegającego na wbudowaniu do cząsteczki substratu, całej cząsteczki tlenu

·         Oksygenazy mieszane zwane monooksygenazami lub hydroksylazami. Podobnie jak oksygenazy właściwe, katalizują proces wbudowywania tlenu do cząsteczki substratu, z tą różnicą, że oksgenazy mieszane wbudowują tylko jeden atom tlenu z dwuatomowej cząsteczki tlenu. Wymagają dodatkowego donora wodoru do redukcji drugiego atomu tlenu

- oksydazy

              Ich rolą jest przenoszenie elektronów i protonów z donora na tlen cząsteczkowy. Produktami takiego działania jest utleniony związek organiczny i najczęściej woda (czasem nadtlenek wodoru)

              Dzielą się na:

·         Oksydazy wytwarzające wodę (miedzioproteiny)

·         Oksydazy wytwarzające nadtlenek wodoru tzw. oksydazy flawinowe bądź flawoproteidy

- enzymy rozkładające nadtlenek wodoru

              Jak sama „nazwa” wskazuje, są to enzymy rozkładające nadtlenek wodoru. Zaliczają się do nich

·         Peroksydazy – katalizują przeniesienie odłączonych atomów wodoru z substratów na nadtlenek wodoru

·         Katalazy – rozkładają nadtlenek wodoru bez żadnego dodatkowego substratu. Może wykazywać również aktywność peroksydazy poprzez katalizowanie oderwania atomu wodoru od substratów organicznych.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1.Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego

Do doświadczeń wykonywanych w tym zadaniu będziemy używać ekstraktu enzymatycznego, który, dla rzodkiewki, należy przygotować w następujący sposób:

- rzodkiewkę obrać ze skórki – skórka rzodkiewki zawiera polifenole będące barwnymi substancjami, przeszkadzającymi w późniejszym określeniu barwy podczas miareczkowania

- obraną rzodkiewkę zetrzeć na tarce, a następnie odważyć z tego 20g

- wrzucić odważoną ilość do erlenmayerki, dodać 0,5g węglanu wapnia (buforuje on środowisko) i zalać wodą destylowaną tak, aby cała objętość była równa około 200cm3, całość zamieszać

- przygotowaną mieszaninę odstawić na 15 minut celem ekstrakcji enzymów

- po 15 minutach przesączyć ją na lejku przez watkę – uzyskany przesącz to właśnie ekstrakt enzymatyczny

W podobny, lecz trochę inny sposób, przygotowane zostały także ekstrakty enzymatyczne z: banana, kapusty włoskiej i chrzanu.

2.Analiza jakościowa

Dzięki przeprowadzonej analizie jakościowej będziemy mogli stwierdzić czy w badanym surowcu znajdują się oksydoreduktazy i pobieżnie określić ich ilość, bez dokładnych wartości. Wykrywane będą: katalaza, oksydaza orto-difenolowa oraz peroksydaza.

Ćwiczenie wykonane dla ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki. Równocześnie, przez inne grupy, ćwiczenie to zostało wykonane dla banana, kapusty włoskiej i chrzanu.

Wykonanie ćwiczenia:

W sześciu probówkach umieścić po 5 ml ekstraktu enzymatycznego. Następnie do każdej z nich (oprócz probówki nr 1) dodać inny odczynnik:

1 – nie dodawać nic, jest to próba odniesienia, na podstawie której będziemy opisywać zmiany w pozostałych probówkach

2 – dodać 10 kropli 1% roztworu H2O2

3 – dodać 10 kropli 1% roztworu katecholu

4 – dodać 10 kropli 1% roztworu pirogalolu

5 – dodać 10 kropli 1% roztworu katecholu i 10 kropli 1% roztworu H2O2

6 – dodać 10 kropli 1% roztworu pirogalolu i 10 kropli 1% roztworu H2O2

Przeprowadzone obserwacje razem z oceną aktywności enzymów zostały zamieszczone w tabeli 1.

Tabela 1. Wyniki analizy jakościowej aktywności katalazy, oksydazy orto-difenolowej i

    peroksydazy w ekstrakcie enzymatycznym z rzodkiewki

„-” - brak aktywności enzymu

„+/-” – znikoma aktywność enzymu

„+” / „++” / „+++” – mała / średnia / wysoka aktywność enzymu

Wnioski:

W probówce nr 2 o obecności katalazy świadczą wydzielające się pęcherzyki gazu. Tłumaczy to reakcja katalizowana przez ten właśnie enzym:

Ta reakcja pokazuje nam, że pęcherzyki gazu to cząsteczkowy tlen ulatniający się z probówki zawierającej tą próbę. Aktywność katalazy oceniona została jako średnia.

Probówki nr 3 i nr 4 posłużyły do wykrycia oksydazy o-difenolowej. Jak widać, w probówce nr 3, roztwór nie zmienił swojego wyglądu ani konsystencji i pozostał taki jak próba odniesienia. Świadczy to o braku aktywności tejże oksydazy, czyli jednocześnie o braku jej obecności w badanym ekstrakcie enzymatycznym. Podobnie jest w przypadku probówki nr 4. Roztwór pozostałby taki, jaka jest próba odniesienia, gdyby nie fakt, że roztwór pirogalolu ma kolor lekko żółty i po dodaniu do probówki zabarwił on badany roztwór na wspomniany kolor. Gdyby w ekstrakcie enzymatycznym z rzodkiewki oksydaza orto-difenolowa była obecna, to w próbie z katecholem zaszłaby następująca reakcja:

W probówkach nr 5 i nr 6 użyte odczynniki umożliwiły nam wykrycie enzymu zwanego peroksydazą. O obecności tego enzymu świadczy zabarwienie roztworu na kolory zbliżone do brązowego, które są skutkiem powstawania barwnych związków, np. purpurogaliny z pirogalolu, przy udziale peroksydazy. Powstające równocześnie pęcherzyki gazu to wydzielający się gazowy CO2. Ponieważ powstałe barwy były intensywne, aktywność peroksydazy została oceniona jako wysoka. W próbie z pirogalolem reakcja zachodziła według następującego schematu:

3.Analiza ilościowa

Analiza ilościowa posłuży nam do określenia dokładniejszej, liczbowej wartości aktywności enzymu, dzięki czemu będziemy mogli porównać ze sobą aktywności wszystkich wykrywanych enzymów z badanego surowca. Tak jak w poprzednio wykrywane będą: katalaza, oksydaza orto-difenolowa oraz peroksydaza.

Ćwiczenie wykonane dla ekstraktu enzymatycznego z rzodkiewki. Równocześnie, przez inne grupy, ćwiczenie to zostało wykonane dla banana, kapusty włoskiej i chrzanu.

Oznaczanie akty...