J. Michałkiewicz1,3,4, M. Krotkiewski2, L.Gackowska1, M.Wyszomirska-Gołda1,
A. Helmin1, D.Dzierżanowska3, and K. Madaliński4
1 Dept. Immunology, Rydygier’s Medical Academy, Bydgoszcz, Poland
2 The Sahlgrenska Academy at Göteborg University, Institute of Clinical Neuroscience, Göteborg, Sweden
3 Dept. Microbiology and Clinical Immunology, Children’s Memorial Hospital,
Warsaw, Poland,
4 Dept. Immunopathology, National Institute of Hygiene, Warsaw, Poland
Streszczenie.
Celem pracy było przedstawienie mechanizmów immunologicznych, które leżą u podstaw modulacji przez probiotyki reakcji odpornościowych. Podano podstawowe informacje dotyczące odporności naturalnej i adaptacyjnej, z uwzględnieniem charakterystycznych cech śluzówkowego układu immunologicznego. Opisano następujące zagadnienia:1) definicja, dzialanie ogólne probiotyków, szczepy bakterii probiotycznych, 2) cechy charakterystyczne śluzówkowego ukladu immunologicznego, 3) dzialanie probiotyków na uklad odporności naturalnej (fagocytoza, komórki NK, modulacja syntezy cytokin, prezentacja antygenu-efekt adjuwantowy) oraz odporności adaptacyjnej (synteza przeciwciał).
I. Definicja pojęcia „probiotyki” i ich działanie ogólne:
Są to żywe mikroorganizmy, stanowiące integralna część fizjologicznej mikroflory jelitowej, które wpływają korzystnie na stan zdrowia poprzez oddziałowywanie na skład i funkcje mikroflory błon śluzowych układu pokarmowego, oddechowego i moczowopłciowego. Szczególne uznanie jako probiotyki znalazły różne gatunki pałeczek kwasu mlekowego (lactic acid bacteria- LAB). Należą do nich: Lactobacillus: L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. gasseri, L. johnsoni, L. lactis L. bulgaricus, L. plantarum, L. salivarius, L. rhamnosus, L. reuteri, Bifidobacterium: B. bifidum, B.longum, B.infantis, oraz Streptococcus: S. termophilus. Stosowane są przy produkcji jogurtów i innych przetworów opartych na mleku fermentowanym. Lactobacillus i Bifidobacterium są to Gram dodatnimi pałeczkami , stanowiącymi znaczną część normalnej mikroflory jelitowej u człowieka i zwierząt.
Generalnie pałeczki Lactobacillus mają złożone wymagania pokarmowe, są bakteriami fermentujacymi, beztlenowymi, lub tolerujacymi tlen, rozwijają się w środowisku kwaśnym i zasadowym. Są szeroko rozpowszechnione i występują wszędzie tam gdzie istnieje środowisko bogate w substraty zawierające węglowodany: tj. w obrębie błon śluzowych u ludzi i zwierzat (dzięki obecności wydzieliny śluzowej), oraz w materiale pochodzenia roślinnego. W jelicie grubym u dorosłego ich liczba wynosi od 106-108/gram zawartości jelita.
Pałeczki kwasu mlekowego (Lactobacillus i Bifidobacterum) wywierają szereg korzystnych dla ustroju zjawisk. Ułatwiają proces trawienia białek, cukrów (prostych i złożonych) oraz tłuszczów, zwiększają absorbcję witamin i minerałów, zwiększają oporność fizjologicznej mikroflory bakteryjnej na działanie antybiotyków, łagodzą odczyny zapalne wywołane przez bakterie, grzyby (np. Candida) i wirusy (np. biegunki wywołane przez rotawirusy), osłabiają reakcje alergiczne, wzmagają anty-bakteryjne i anty-grzybicze i anty-wirusowe reakcje odpornościowe, mają działanie przeciwnowotworowe, redukują eliminację produktów katabolizmu białek tłuszczów i węglowodanów przez nerki i wątrobę, zmniejszają poziom cholesterolu w surowicy i ograniczają osteoporozę. Mechanizmy indukcji tych aktywności nie są jeszcze ostatecznie poznane. Wykazano, że drobnoustroje te: a) modyfikują pH przewodu pokarmowego, b) wytwarzają czynniki blokujące działanie chorobotwórczych dronoustrojów (bakteryjnych i wirusowych), c) współzawodniczą z drobnoustrojami patogennnymi o receptory komórkowe, składniki pokarmowe i czynniki wzrostowe, d) wytwarzają laktazę, e) stymuluja nieswoiste i swoiste reakcje odpornościowe -działanie immunomodulacyjne [1]
II. Wpływ bakterii probiotycznych na reakcje odpornościowe.
Mikroflora jelitowa stanowi niezwykle złożony ekosystem, zawierajacy przeszło 400 gatunków bakterii (ogółem około 1014 drobnoustrojow, tj. 10 x więcej niż wszystkich komórek ustroju). Najliczniej reprezentowane sa takie gatunki jak Bacterioides, Eubacterium, Peptostreptococcus, pałeczki rodziny Enterobacteriacae, Bifidobacterium , Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium i Staphylococcus. Niektóre z tych drobnoustrojów są potencjalnie patogenne a inne wywierają korzystne dzialania dla ustroju Dlatego kolonizacja układu pokarmowego przez określone gatunki drobnoustrojów ma znaczny wpływ na ogólne uwarunkowania zdrowotne (podatność na infekcje, alergie, efekty toksyczne i karcynogenne). Takie czynniki jak wiek, przyzwyczajenia żywieniowe, stan immunologiczny, stosowanie antybiotyków, stres, alkohol, oraz pH treści jelitowej, czasokres pasażu tresci pokarmowej i jej skład wpływaja na skład mikroflory jelitowej i jej aktywności metaboliczne. Stanowiło to podstawową przesłankę do użycia bakterii probiotycznych jako składnika diety, w celu modulowania składu mikroflory jelitowej. Drobnoustroje mikroflory jelitowej są głownym czynnikiem stymulującym układ immunologiczny, co jest warunkiem rozwoju struktur limfoidalnych tego układu (zwierzęta laboratoryjne urodzone i przetrzymywane w warunkach sterylnych ich nie rozwijają). Działanie immunomodulacyjne mikroflory jelitowej w tym i bakterii probiotycznych opiera się na trzech z pozoru przeciwstawnych zjawiskach: 1) indukowaniu i utrzymywaniu stanu tolerancji immunologicznej na antygeny środowiskowe (pokarmowe i wziewne), 2) indukcji i kontroli reakcji odpornościowych przeciwko patogenom pochodzenia bakteryjnego, wirusowego i nowotworowego, 3) hamowaniu reakcji autoagresyjnych i uczuleniowych. Wszystkie te trzy zjawiska zachodzą jednocześnie w tzw śluzówkowym układzie limfoidalnym (mucosa associated lymphoid tissue –MALT). Jest to złożony system który u człowieka dorosłego ochrania łacznie około 400 m2 powierzchni śluzówek przewodu pokarmowego, oddechowego, moczowopłciowego, a także gruczoły ślinowe, łzowe i mleczne. Układ ten jest czynnościowo zintegrowany, co umożliwia: a) migrację uczulonych w określonym obszarze limfocytów do wielu innych obszarów tego układu, b) interakcje z obwodowym, poza śluzówkowym układem odpornościowym. Układ MALT obejmuje: migdałki, nieotorbione struktury tzw pojedyńczych, rozproszonych grudek chłonnych oraz skupiska grudek chłonnych zorganizowanych w tzw kępkach Peyera, które występują najliczniej w odcinku dystalnym jelita cieńkiego. Odcinek ten stanowi główną składową tkanki limfoidalnej związanej z układem pokarmowym (gut-associated lymphoid tissue-GALT). W skład GALT wchodzi ponadto wyrostek robaczkowy, oraz liczne skupiska grudek limfoidalnych rozsianych w całym przewodzie pokarmowym. Jelito cieńkie jest relatywnie słabo zasiedlone przez bakterie komensalne ( od 103 CFU/g treści w odcinku proksymalnym dwunastnicy, do 105-108 w odcinku dystalnym ileum). Przyjmując, że populacja bakterii w jelicie cieńkim stanowi około 1/10.000 jej poziomu w jelicie grubym, to całkowita ich liczba w jelicie cieńkim nie przekracza 1010 bakterii. Dlatego też podawanie około 1010-1011 bakterii probiotycznych dziennie (najczęściej stosowana dawka) może wywierać znaczacy wpływ na układ immunologiczny przewodu pokarmowego (GALT), nawet jeżeli dawka ta jest mała w porównaniu do ilości bakterii mikroflory jelita grubego (1014 ). Ponieważ kępki Peyera (skupiska tkanki limfoidalnej) czynnościowo predysponowane są do wychwytywania wszystkich korpuskularnych struktur obecnych w świetle jelita cieńkiego, to bakterie probiotyczne nie musza wykazywać właściwości adherencyjnych, aby stymulować komórki układu odpornościowego [2,3] Aktywność tego układu jest wypadkową ciągłej stymulacji komórek tzw odporności wrodzonej oraz adaptacyjnej.
Odporność wrodzona zależy od wielu typów komórek (limfocyty NK, granulocyty, monocyty, makrofagi, komórki dentrytyczne, komórki tuczne) i białek (cytokiny, dopełniacz, białka ostrej fazy). Typowymi dla GALT elementami odporności wrodzonej są: niskie pH (sok żołądkowy, kwasy żółciowe), perystaltyka, opłaszczanie i bezpośrednie usuwanie drobnoustrojów przez wydzielinę śluzową (mucus), obecność lizozymu i defensyn (grupy peptydów o właściwościach anty-bakteryjnych, anty-wirusowych, przeciw grzybiczych), oraz warstwa komórek epitelium, tworząca ochronną barierę jelitową, pozostajaca w bezpośrednim kontakcie ze światłem jelita. Komórki epitelium pełnią szereg funkcji odporności naturalnej: a) wytwarzają lizozym, defensyny oraz fosfolipazę A2, b) wykazuja ekspresję szeregu cytokin takich jak chemokiny (IL-8, MCP-1 i inne), TNF-alfa, IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TGF-b, c) są zdolne do ograniczonej prezentacji antygenów limfocytom T, d) wykazuja ekspresję receptorów błonowych o funkcji kostymulacyjnej wobec limfocytów T (HLA-DR, CD11a, etc), lecz nie działają jako tzw „profesjonalne” komorki prezentujące (brak ekspresji CD80, CD86), co wiąże się z ich funkcją w procesie indukcji tolerancji immunologicznej (niekompletna prezentacja antygenu, slaby sygnał kostymulacyjny). Inne komórki układu odporności naturalnej to limfocyty NK (bardzo heterogenna populacja w systemie GALT), pewna frakcja limfocytów T [z ekspresją receptorów dla antygenu (TcR) typu gd (20%) i lub ab (50%)], a także granulocyty, makrofagi Zaliczenie pewnych typów limfocytów T (komórki intraepitelialne-IEL) do układu odporności naturalnej spowodowane jest: 1) ich niezależność rozwojową od grasicy, wyrażajaca się nietypową strukturą ich receptorów TcR, tj. homodimerycznymi łańcuchami ab oraz ekspresją receptora CD8 o niekompletnej strukturze (w porównaniu do klasycznych komorek T grasiczego pochodzenia). Wspólnymi cechami komórek układu odporności naturalnej są: a) udział w poczatkowej fazie odpowiedzi immunologicznej, b) brak rozpoznawania antygenu z udzialem receptorów komorkowych o restrykcji klonalnej, c) brak pamięci immunologicznej. Podstawowym zadaniem „naturalnych” reakcji odpornościowych jest maksymalne zmniejszenie ilości czynnika stymulujacego i przygotowanie optymalnej odpowiedzi adaptacyjnej (zależnej od limfocytów T i B) głównie poprzez stworzenie określonego mikrośrodowiska cytokinowego, w którym dochodzi do prezentacji antygenu limfocytom T, ich aktywacji oraz stymulacji limfocytów B i syntezy przeciwciał.
Odporność adaptacyjna zależy od immunokompetentnych limfocytów T i B, których wspólną cechą jest: a) udział w pozniejszej fazie odpowiedzi odpornościowej (w przypadku pierwszego kontaktu z antygenem), b) rozpoznawanie antygenu poprzez receptory komorkowe o restrykcji klonalnej, c ) pamięć immunologiczna [3,4]
IIa. probiotyki a układ odporności wrodzonej.
Generalnie bakterie probiotyczne wpływają stymulująco na układ odporności naturalnej poprzez: a) wzmaganie aktywności fagocytarnej granulocytów oraz makrofagów oraz ich właściwości bójczych i cytostatycznych, b) aktywację komórek NK, c) indukcję syntezy cytokin, d) modulację zdolności prezentacji antygenu limfocytom T, co jest z kolei podstawą 2 przeciwstawnych zjawisk: tzw efektu adjuwantowego oraz tolerancji obwodowej indukowanej przez antygeny podane per os.
·Modulacja aktywności enzymatycznej i fagocytarnej makrofagów i granulocytów
Wzmaganie przez probiotyki aktywności enzymatycznej i fagocytarnej makrofagów i granulocytów obserwowano zarówno in vitro, tj. po ich dodaniu do hodowli zawierajacych te komórki jak i in vivo- injekcja dootrzewnowa (u myszy) i podanie doustne (u myszy i człowieka). Pozytywny efekt uzyskiwano zarówno przy zastosowaniu żywych szczepów bakterii probiotycznych jak i zabitych bakterii lub ich produktów. Efektywność działania zależy od zastosowanych szczepów bakterii i drogi ich podania, tj. parenteralnie lub per os. Np. u myszy już w 2 dni po podaniu dootrzewnowym L. bulgaricus 10-krotnie zwiększał się poziom enzymów lizosomalnych (b-galaktozydazy, b-glukuronidazy, dehydrogenazy mleczanowej) w makrofagach, przy czym żywe bakterie wywoływały większy efekt niż martwe. Szczep L.casei był mniej efektywny (tylko 3-krotny wzrost poziomu enzymów), przy użyciu żywych i martwych bakterii. Oba szczepy podane per os były jednakowo efektywne, indukując większą aktywność enzymatyczną makrofagów w przypadku użycia żywych bakterii. W 2 dni po podaniu dootrzewnym L.bulgaricus kilkakrotnie zwiększała się aktywność fagocytarna makrofagów, utrzymując się na tym poziomie do 8 dnia; przeciwnie, po podaniu per os fagocytoza wzrastala tylko nieznacznie, natomiast L.casei podane dotrzewnowo jak i per os jednakowo wzmagaly fagocytozę zawiesiny koloidalnej karbonylku żelaza. Dootrzewnowe podanie L.casei zwiększalo także aktywność fagocytaną komórek ukladu siateczkowo śródbłonkowego. Wzrost aktywności fagocytarnej i enzymatycznej makrofagów wywoływały nie tylko żywe lub martwe pałeczki Lactobacillus, lecz także ich produkty: a) ekstrakty białkowe Bidobacterium longum, lecz nie L.acidophilus zwiększaly poziom fosfodiesterazy alkalicznej (hydrolaza) w makrofagach; ektrakty z obu szczepów jednakowo wzmagaly fagocytozę cząsteczek akrylamidu lub żywych bakterii S.typhi murium, b) fosfopolisacharydy pochodzące ze szczepu L.dulbrueckii ssp. bulgaricus, podane dootrzewnowo, zwiekszały zarówno liczbe makrofagów, ich aktywność cytostatyczną wobec linii komórek nowotworowych: sarcoma –180 oraz P388, oraz aktywność fagocytarną (cząsteczek lateksu). L.casei był bardziej efektywny aniżeli L.bulgaricus. Poszerzeniem tych badań było podawanie per os mleka sfermentowanego zawierającego wybrane szczepy Lactobacillus, a następnie ocena ich wplywu na funkcje makrofagow (otrzewnej i śledziony-u myszy) oraz monocytow i granulocytów krwi obwodowej (człowiek). Makrofagi otrzewnej i śledziony myszy skarmianych mlekiem sfermentowanym przez L.casei. L.acidophilus. L.rhamnosus HN001 wykazywały zwiekszona aktywność fagocytarną in vivo (clearance cząsteczek karbonylku żelaza) i in vitro (S.typhi, opsonizowane S.typhi), oraz posiadaly zwiększony poziom enzymów lizosomalnych. Podobne wyniki opisano u ludzi. Podawanie przez trzy tygodnie mleka fermentowanego zawierajacego L.acidophilus szczep La1 lub B.bifidum szczep Bb12 zwiększało zarówno aktywność fagocytarną in vitro monocytów granulocytów (fagocytoza opsonizowanych E.coli), oraz ich liczbę we krwi obwodowej do 6 tygodni po odstawieniu podawania. Inne szczepy Lactobacillus takie jak B.lactis szczep HN0019 raz L.rhamnosus szczep HN001 (izolowany z sera) wywoływaly podobne aktywności granulocytów i monocytów ( 5-7).
Zwiększanie aktywności fagocytarnej granulocytow krwi obwodowej oraz makrofagów śledziony i jamy otrzewnej poprzez doustne podawanie bakterii probiotycznych wskazuje, że bakterie te nie tylko indukują lokalnie śluzowkowy układ odpornościowy, lecz także wpływają stymulująco na obwodowy układ odpornościowy. Mechanizm wzmagania aktywności fagocytarnych i bójczych granulocytów i makrofagów przez bakterie probiotyczne nie jest dokładnie znany, lecz może zależeć od : a) stymulującego dzialania niektórych cytokin (IL-1, IL-6, TNF-alfa, IFN-alfa, IFN-a) których synteza wzrasta pod wpływem działania wielu szczepów bakterii probiotycznych; cytokiny te pochodzą prawdopodobnie z enterocytów, komórek dendrytycznych , oraz makrofagow, granulocytów i komórek NK, b) wzrostu opsonizacyjnych aktywności immunoglobulin, c) wzrostu ekspresji niektórych receptorow błonowych granulocytów i makrofagów ( ICAM-1, CD11 b i c, CD32,), zaangażowanych w procesach fagocytozy i aktywnościach cytotoksycznych tych komórek, d) interakcji fagocytów z aktywowanymi komórkami T i NK.
·Aktywacja komórek NK.
Zakres i profil syntezy cytokin przez aktywowane komórki układu odpornościowego leży u podstaw kształtowania przez nie odpowiedzi immunologicznej zarówno naturalnej jak i adaptacyjnej. Wiele szczepów pałeczek Lactobacillus po kontakcie in vitro z populacją jednojądrzastych komórek ludzkiej krwi obwodowej (PBMC: 80% limfocytów + 20% monocytów) indukuje te komorki do syntezy cytokin, takich jak TNF-alfa, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN-gamma [11]. Wszystkie one (z wyjątkiem IL-10) należą do tzw „prozapalnych” cytokin typu Th1. Zakres ich syntezy zależy od stosowanego szczepu Lactobacillus. Niektóre szczepy jak L.rhamnosus , B.animalis czy L.acidophilus były silnymi induktorami TNF-alfa i IL-6 in vitro, a inne (B.longum, B.lactis L.paracasei, E.lactis) słabymi. Większość z badanych szczepów pałeczek Lactobacillus indukowała syntezę IL-10 in vitro w podobnym zakresie ilościowym [11,12]. Z kolei produkcja IFN-gamma in vitro w populacji PBMC indukowanych przez paleczki Lactobacillus zależała od komórek NK [13]. Paradoksalnie, niektóre szczepy pałeczek Lactobacillus nawet silniej indukukowały in vitro prozapalne cytokiny anizeli LPS. W pewnym zakresie znalazło to swoje odzwierciedlenie w warunkach in vivo. Podawanie bowiem probiotyków per os w postaci zawiesiny bakterii lub w mleku fermentowanym wzmagalo pro zapalne aktywności leukocytow krwi obwodowej manifestujace się poprzez: a) samoistną syntezą IFN-g w hodowli leukocytow in vitro, b) zwiększoną ekspresją interferonów (IFN-alfa i IFN-g) oraz 2’-5’ A syntetazy w limfoctach stymulowanych in vitro przez mitogeny, c) wzrost poziomu IFN-g w surowicy. Nie zidentyfikowano komorek odpowiedzialnych za te aktywności. Prawdopodobnie były to komórki NK lub/ i limfocyty T. Podawanie priobiotykow per os wzmagało też zdolność limfocytow krwi obwodowej do syntezy IL-2 po aktywacji tych komórek in vitro przez mitogeny limfocytow T. Wyniki te wskazują, że probiotyki mogą wzmagać niektóre pro-zapalne aktywności limfocytów (synteza cytokin Th1). Czy jest to pożądane zjawisko? Z jednej strony tak, ponieważ obecność tych cytokin determinuje działanie anty-infekcyjne (anty-wirusowe i anty-bakteryjne). Z drugiej strony nie, ponieważ może powodować nadmierne reakcje prozapalne, co w warunkach in vivo byłoby niekorzystne. Cytokiny mają bowiem decydujące znaczenie efektorowe (wzmaganie wielu komorkowych reakcji odpornościowych) jak i regulacyjne (zachowanie równowagi czynnościowej pomiędzy pro i przeciwzapalnymi reaktywnościami komórek układu odpornościowego, tj. odpowiednio Th1 i Th2 zależnymi). Ich synteza w znacznym stopniu zależy od obecności monocytów w hodowli komórkowej. Komórki te bowiem fagocytują bakterie i prezentują ich immunogenne fragmenty limfocytom T. W badaniach in vitro immunogenności preparatu Trilac (Allergon, Szwecja), składajacego się z trzech szczepów pałeczek Lactobacillus (L.acidophilus, B.bifidum i L.bulgaricus) wykazano [14] że były one słabymi induktorami proliferacji limfocytów T CD4+ w 7- dniowych hodowlach. Efekt ten uzyskano także przy zastosowaniu różnych kombinacji tych szczepów w hodowli. W przeciwieństwie do limfocytów, monocyty ulegały jednak silnej aktywacji, co wykazano poprzez: a) wzrost ekspresji HLA-DR, ICAM-1 i innych receptorów na tych komórkach, b) syntezę TNF-alfa [14]. Wyniki te potwierdzają, że większość szczepów Lactobacillus jest słabo immunogenna, tj. limfocyty T nie ulegają silnej aktywacji ponieważ rozpoznają jako obce tylko nieliczne z prezentowanych im antygenów bakteryjnych, a indukowane są monocyty (krew obwodowa) lub/i makrofagi tkankowe. Jest to fizjologiczna reakcja ponieważ zadaniem komensalnej flory jelitowej w odniesieniu do regulacji reakcji odpornościowych jest: a) utrzymywanie komórek układu odpornościowego w takim stanie aktywacji który umożliwiaja ich odnowę, b) unikanie nadmiernych reakcji prozapalnych (poza koniecznością zapewnienia odpowiedniego poziomu reaktywności o działaniu przeciw-infekcyjnym), c) utrzymywanie stanu tolerancji na ogromną różnorodność antygenów (endo i egzogennych) stale obecnych w środowisku układu jelitowego. Synteza cytokin, przy jednoczesnie słabej proliferacji limfocytów T (CD4+) w odpowiedzi na stymulację komórek układu odpornościowego przez probiotyki wskazuje, że komórki T ustroju wykazuja tolerancję na bakterie probiotyczne. Jest to fizjologiczna reakcja, wskazująca, że przy szczelnej barierze nabłonkowo-jelitowej nie dochodzi do uczulania limfocytów T, lecz jedynie ich słabej aktywacji, ściśle kontrolowanej (koniecznej dla odnowy komorkowej i zdolności limfocytow do pełnienia funkcji regulacyjnych i efektorowych). Regulacja poziomu i profilu cytokin syntetyzowanych komórki układu odpornościowego przez bakterie probiotyczne w znacznej mierze zależy od kompozycji gatunków i szczepów danego gatunku oddziałowujących na komórki układu odpornościowego. Np. kombinacja szczepów L.acidophilus, L.bulgaricus i B.bifidum, wchodzacych w skład preparatu Trilac (Alergon, Goteborg, Szwecja), indukuje w populacji PBMC wysoką ekspresję TNF-alfa (cytokina prozapalna) i IL-10 (przeciwzapalna), przy praktycznie braku IFN-gamma i niskim poziomie IL-12 (prozapalne cytokiny). Przeciwnie, L. acidophilus z tego samego preparatu, jest silnym induktorem IL-12, IFN-gamma, i TNF-alfa przy słabej expresji IL-10 [15 ]. Tak więc odpowiednia kombinacja szczepów pałeczek Lactobacillus determinuje ich probiotyczne właściwości w odniesieniu do reakcji odpornościowych, manifestujace się: a) słabą aktywnością prozapalną (słaba ekpresja IL-12, IFN-g...
que-hiciste