BIOCHEMIA
SPRAWOZDANIE
ĆWICZENIE 4
OCZYSZCZANIE BIAŁKA - DIALIZA
Sabina Spyrka
Natalia Wiśniewska
Biotechnologia II
Gr. 5
OPOLE
WPROWADZENIE
Dializa - jest to metoda oczyszczania roztworów koloidalnych z elektrolitów przy użyciu błony półprzepuszczalnej.
Wiązanie peptydowe - umowna nazwa wiązania amidowego występującego między aminokwasami, łączy grupę α-aminową jednego aminokwasu z grupą α-karboksylową drugiego aminokwasu. Występuje ono w dwóch formach rezonansowych: cis i trans.
Reakcja biuretowa - test chemiczny na zawartość protein i innych polipeptydów, w których występują, co najmniej dwa wiązania peptydowe bezpośrednio obok siebie lub są przedzielone nie więcej niż jednym atomem węgla. Test biuretowy polega na dodaniu do analizowanej mieszaniny roztworu fosforanu miedzi(II) (lub siarczanu miedzi(II)) oraz NaOH lub KOH.
CEL ĆWICZENIA
Poznanie metody oczyszczania białek (dializy), umożliwiającej oddzielenie określonego białka od innych zanieczyszczeń tak, aby można było zbadać jego strukturę lub właściwości.
PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA
CZĘŚĆ I – Oddzielenie białka od inny molekuł (forma statyczna)
1. Do probówki wprowadziliśmy 3 cm3 1% roztworu albuminy.
2. Następnie dodaliśmy 2 cm3 3% roztworu chlorku sodu NaCl.
3. Dokładnie wymieszaliśmy wszystko i umieściliśmy w worku dializacyjnym.
4. Worek zanurzyliśmy w zlewce zawierającej 150 cm3 wody destylowanej.
5. Następnie pobieraliśmy co 15 min. próbki ze zlewki w celu oznaczenia czasu pojawienia się soli i białka w płynie na zewnątrz worka. (w ten sposób dokonaliśmy czterech pomiary w tym jednego roztworu z worka dializacyjnego).
CZĘŚĆ II – Reakcja biuretowa Piotrkowskiego na obecność białka w roztworze
1. Odmierzyliśmy do probówki 1 cm3 roztworu ze zlewki.
2. Następnie dodaliśmy 1 cm3 10% roztworu wodorotlenku sodu NaOH.
3. Następnie dodaliśmy 4 krople 0,5% roztworu siarczanu miedzi(II) CuSO4.
4. Zawartość probówki dokładnie wymieszaliśmy.
5. Obserwowaliśmy zmiany jakie zaszły w roztworach.
WYNIKI I WNIOSKI:
Kolejno pobierane (co około 15 minut) próbki po dodaniu do nich roztworu wodorotlenku sodu i 4 kropel roztworu siarczanu miedzi barwiły się delikatnie na niebieskofioletowy kolor. Im dłużej worek dializacyjny umieszczony był w zlewce tym kolor zabarwienia stawał się minimalnie intensywniejszy. Pozytywny wynik tej próby świadczy o niewielkiej zawartości białka w roztworze na zewnątrz worka, białka tworzą bowiem z jonami miedziowymi barwny kompleks. Minimalna część białka musiała się przedostać na zewnątrz worka, spowodowane mogło być to niedokładnym zawiązaniem worka, zanurzeniem gumeczki uszczelniającej worek lub innymi błędami popełnionymi przez nas.
Ostatnia próbka pobrana bezpośrednio z worka dializacyjnego po dodaniu wyżej wymienionych odczynników zabarwiła się intensywnie na kolor fioletowy, świadczy to o dużej zawartości białka w worku.
CZEŚŚĆ III – Oznaczenie jonów chlorkowych Cl -
2. Następnie dodaliśmy 2 krople 5% roztworu azotanu srebra AgNO3.
3. Obserwowaliśmy zmiany jakie zaszły w roztworach.
Kolejno pobierane (co około 15 minut) próbki po dodaniu do nich 2 kropel roztworu azotanu srebra stawały się biało mętne. Im dłużej worek dializacyjny umieszczony był w zlewce tym roztwór stawał się bardziej mętny. Pozytywny wynik tej próby świadczy o zwiększającej się z czasem zawartości jonów chlorkowych w roztworze na zewnątrz worka, w wyniku bowiem tej reakcji tworzy się serowaty roztwór chlorku srebra.
Ostatnia próbka pobrana bezpośrednio z worka dializacyjnego po dodaniu wyżej wymienionych odczynników stała się mniej intensywnie mętna, świadczy to o zmniejszającej się zawartości jonów chlorkowych.
Konduktywność cieczy w zlewce po wszystkich pomiarach (około 1 godzina) wynosiła 107
biobird