ćw 3 analiza i funkcje białek.pdf

Ć wiczenie 3

ANALIZA I OCZYSZCZANIE BIAŁEK

Cz ęść do ś wiadczalna obejmuje:

- rozdział białek zawartych w surowicy krwi metodą elektroforezy w Ŝelu agarozowym

- rozdział hemoglobiny od chromianu potasu metodą sączenia Ŝelowego na kolumnie

Sephadex G-15 (odsalanie hemoglobiny)

WPROWADZENIE

Poznanie funkcji określonego białka wymaga jego wyizolowania i oczyszczenia (oddzielenia)

od tysięcy innych białek obecnych w badanych ekstraktach komórkowych lub tkankowych. Białko

moŜna oddzielić od innych cząsteczek, w tym równieŜ od innych białek, wykorzystując róŜnice w:

rozpuszczalno ś ci , wielko ś ci cz ą steczek , w wielko ś ci ładunku , a takŜe róŜnic w powinowactwie

do specyficznych grup chemicznych . RóŜnice między poszczególnymi białkami w ich rozpusz-

czalności wykorzystywane są w metodzie frakcjonowania białek poprzez wysalanie lub wytr ą ca-

nie na skutek obni Ŝ ania stałej dielektrycznej roztworu. Białka zawierające małe cząsteczki (np.

siarczan amonu uŜywany do wysalania) moŜna oddzielić metodą dializy przez błonę półprzepusz-

czalną (np. błona celulozowa) bądź metodą filtracji Ŝelowej. Chromatografia metodą filtracji Ŝ elo-

wej umoŜliwia rozdział cząsteczek róŜniących się wielkością. Powszechnie stosowanymi Ŝelami są

preparaty handlowe takie jak: Sephadex, Sepharose czy Biogel. Sephadex produkuje się z natural-

nego dekstranu wytwarzanego przez Leuconostoc mesenteroides (paciorkowce heterofermentatyw-

ne; fakultatywne anaeroby) . Ten wielkocząsteczkowy glikan zawiera 90-95% wiązań

-1-6 gliko-

zydowych, a pozostałe wiązania są typu 1-3 (Ryc. 1). RóŜne rodzaje Sephadex uzyskuje się z dek-

stranu o róŜnej masie cząsteczkowej, który dodatkowo sieciuje się w reakcji z epichlorohydryną.

Liczba wytworzonych mostków określa rozmiary oczek w utworzonej w ten sposób sieci. Im więcej

poprzecznych mostków znajduje się w sieci, tym mniejsze są jej oczka. W ten sposób produkuje się

serię Ŝeli Sephadex o róŜnych liczbach G róŜniących się rozmiarami oczek, umoŜliwiających

frakcjonowanie i rozdział analizowanych związków w szerokim zakresie mas cząsteczkowych

(Tabela I) . śelem o najmniejszych oczkach jest Sephadex G-10, natomiast o największych G-200.

Do oddzielenia związków o małej masie cząsteczkowej od wielkocząsteczkowych białek najlepiej

nadają się kolumny Sephadex G-10 lub G-15, natomiast do rozdziału białek róŜniących się wielko-

ścią – kolumny Sephadex G-50 do G-200 (Ryc. 2). Na ryc. 2 pokazano zasadę rozdziału substancji

róŜniących się wielkością cząsteczek na kolumnie Sephadex.

Ryc. 1. Fragment struktury Ŝelu Sephadex (widoczne są wiązania α-1-6 glikozydowe oraz mostki

powstałe w reakcji z epichlorohydryną) (Kłyszejko- Stefanowicz 2005)

Tabela I. Charakterystyka Ŝeli Sephadex G (Kłyszejko-Stefanowicz 2005)

Ryc. 2 . Rozdział cząsteczek o róŜnej wielkości na kolumnie Sephadex (Koolman, Röhm 2005)

Chromatografia jonowymienna wykorzystuje róŜnice w ładunkach wypadkowych poszczegól-

nych białek. Białka, które w określonym pH będą naładowane ujemnie moŜna rozdzielać na anioni-

tach np. na dietyloaminoetylocelulozie (DEAE-celuloza), białka naładowane dodatnio moŜna roz-

dzielać na kationitach np. karboksymetylocelulozie (CM-celuloza). W chromatografii powinowac-

twa wykorzystuje się powinowactwo wielu białek do specyficznych grup chemicznych. W ten spo-

sób moŜna związać określone białko enzymatyczne do nośnika chromatograficznego, do którego

wcześniej został sprzęgnięty substrat, analog substratu bądź specyficzny inhibitor tego enzymu.

Białka regulujące ekspresję genów moŜna związać do odpowiedniej sekwencji nukleotydowej DNA

unieruchomionej na nośniku chromatograficznym itd. Wysokoci ś nieniowa chromatografia cie-

czowa (HPLC) wykorzystuje materiały wypełniające kolumnę o znacznie wi ę kszym rozdrobnie-

niu niŜ w klasycznych chromatografiach cieczowych i dlatego aby uzyskać odpowiednią szybkość

przepływu konieczne jest zastosowanie zwiększonego ciśnienia.

Powszechną metodą rozdziału białek jest elektroforeza w róŜnych nośnikach. Cząsteczka ob-

darzona ładunkiem wypadkowym porusza się w polu elektrycznym, a szybko ść jej w ę drówki ( v )

zaleŜy od nat ęŜ enia pola elektrycznego ( E ), od wypadkowego ładunku cz ą steczki białka ( z ) i

współczynnika tarcia ( f ).

v = Ez/f

Współczynnik tarcia zaleŜy od wielko ś ci i kształtu cz ą steczki migrującej oraz od lepko ś ci ś ro-

dowiska .

Rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze w Ŝelu lub na bibule. Dawniej jako no-

śników, oprócz bibuły chromatograficznej, uŜywano takŜe Ŝelowanej skrobi oraz folii z octanu ce-

lulozy; obecnie poza octanem celulozy powszechnie uŜywa się Ŝeli agarozowych i poliakryloami-

dowych, umoŜliwiających najwyŜszą rozdzielczość.

Agaroza jako antykonwekcyjny no ś nik do elektroforezy została zaproponowana przez Hjertena w 1961 r. Od

tego czasu jest niezast ą pionym no ś nikiem, zwłaszcza do ró Ŝ nego typu immunoelektroforez, a tak Ŝ e do roz-

działu i analiz kwasów nukleinowych. Rozdziały elektroforetyczne tych biopolimerów w agarozie mo Ŝ na wy-

konywa ć zarówno na skal ę analityczn ą jak i preparatywn ą .

Agaroza jest polisacharydem (główny składnik agaru) zbudowanym z powtarzaj ą cych si ę reszt

-D-

-L-galaktopiranozy poł ą czonych wi ą zaniami 1-3 oraz 1-4. Ryc. 3 przed-

stawia powtarzaj ą c ą si ę podjednostk ę agarozy

CH 2 OH O

O O

HO O

Ryc. 3 . Budowa agarozy (powtarzający się fragment)

Obie reszty galaktozowe w agarozie mog ą by ć w ró Ŝ nym stopniu podstawione grupami siarczanowymi, me-

toksylowymi, karboksylowymi i pirogronianowymi. Agaroza u Ŝ ywana do elektroforezy powinna charaktery-

zowa ć si ę jak najni Ŝ sz ą zawarto ś ci ą zjonizowanych grup (siarczanowych, karboksylowych), które otoczone

s ą dodatnio naładowanymi przeciwjonami. W polu elektrycznym ruchliwe przeciwjony, wraz z towarzysz ą c ą

im otoczk ą , migruj ą w kierunku katody. Taki przepływ solwentu (nazywany elektroendoosmoz ą ), zale Ŝ ny jest

od liczby zjonizowanych grup w agarozie i zachodzi w kierunku przeciwnym ni Ŝ w ę drówka rozdzielanych

galaktopiranozy i 3,6-anhydro-

białek, wpływaj ą c niekorzystnie na jako ść ich rozdziału. Wielko ść elektroendosmozy jest wyznaczana na

podstawie w ę drówki substancji nie posiadaj ą cej ładunku elektrycznego np. dekstranu i jest wyra Ŝ ana jako

wzgl ę dna ruchliwo ść elektroforetyczna (Mr) dekstranu w odniesieniu do ruchliwo ś ci elektroforetycznej al-

buminy. Poniewa Ŝ dekstran w ę druje w kierunku przeciwnym do albuminy, warto ść Mr ma znak ujemny. W

sprzeda Ŝ y wyst ę puj ą trzy podstawowe typy agarozy: o niskiej (Mr <0.02), ś redniej (Mr < 0.13) i wysokiej

(Mr > 0.25) elekroendosmozie. Do elektroforezy białek u Ŝ ywa si ę dwóch pierwszych typów agarozy. W st ę -

Ŝ eniach > 0.1% i w temperaturze ni Ŝ szej od 40 0 C agaroza zestala si ę , tworz ą c Ŝ el. Po ogrzaniu do tempera-

tury >90 0 C, „topi si ę ” przechodz ą c w posta ć zolu. Podczas ochładzania poszczególne ła ń cuchy polisacha-

rydowe tworz ą podwójne helisy, które nast ę pnie ł ą cz ą si ę w p ę czki i tworz ą stabilny Ŝ el o oczkach, których

wielko ść uzale Ŝ niona jest od st ęŜ enia agarozy. Elektroforez ę białek i kwasów nukleinowych wykonuje si ę

najcz ęś ciej w 1 – 2% Ŝ elach agarozowych.

Warunki elektroforezy (pH i siłę jonową) dobiera się najczęściej tak, aby sumaryczny ładunek

elektryczny poszczególnych białek obecnych w próbie poddanej elektroforezie był ujemny i tak

Ŝeby róŜniły się one tylko wielkościami ładunku netto. W praktyce najczęściej stosuje się bufory

zasadowe, których pH jest wy Ŝ sze od warto ś ci pI najbardziej zasadowych białek . W tych wa-

runkach wszystkie rozdzielane białka poruszaj ą si ę w jednym kierunku (do anody) lecz z ró Ŝ n ą

szybko ś ci ą , zale Ŝ n ą od stopnia jonizacji. NaleŜy dodać, Ŝe na jakość rozdziału wpływ ma równieŜ

rodzaj uŜytego buforu.

Po zakończeniu elektroforezy białka na elektroforegramie denaturuje się (utrwala) w mieszani-

nie kwasu octowego i metanolu (lub etanolu), wskutek czego białka stają się nierozpuszczalne.

Unieruchomione białka moŜna teraz wybarwia ć. Do wybarwiania uŜywa się róŜnych barwników

oddziałujących jonowo z białkami (są to najczęściej barwniki sulfonowe, pochodne lub analogiczne

do stosowanych w przemyśle tekstylnym do barwienia wełny). Nadmiar niezwiązanego barwnika

odmywa się, a wybarwione elektroforegramy poddaje się analizie jakościowej lub ilościowej. Po-

niewaŜ ilość związanego barwnika jest proporcjonalna do zawartości białka w danym prąŜku, dla-

tego mierz ą c densytometrycznie intensywność zabarwienia poszczególnych pasm moŜna ozna-

czyć wzgl ę dne st ęŜ enie białek w rozdzielonych frakcjach (Tabela IIB). Metoda ta znajduje zasto-

sowanie do analizy klinicznej białek surowicy krwi. Wzajemne proporcje białek surowicy krwi

utrzymują się w określonych granicach, a zmiany tych proporcji są charakterystyczne dla róŜnych

stanów patologicznych.

WYKONANIE

Elektroforetyczny rozdział białek zawartych w surowicy krwi z u Ŝ yciem aparatu

i zestawu odczynników firmy Cormay (Gel protein 100)

1, Zestaw odczynników do elektroforezy firmy Cormay (Gel protein 100)

A, Płytki z agarozą (folie)

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: