Enzymy degradujące arabinoksylany.pdf

YWNO . Nauka. Technologia. Jako , 2006, 1 (46), 5 - 20

DOMINIK SZWAJGIER, ZDZISŁAW TARGO SKI

CHARAKTERYSTYKA ENZYMÓW POCHODZENIA

MIKROBIOLOGICZNEGO BIOR CYCH UDZIAŁ W DEGRADACJI

ARABINOKSYLANÓW I ICH ROLA W POZYSKIWANIU KWASU

FERULOWEGO Z WYSŁODZIN PIWOWARSKICH

S t r e s z c z e n i e

Celem pracy było scharakteryzowanie enzymów pochodzenia bakteryjnego i grzybowego bior cych

udział w degradacji arabinoksylanów. W szczególno ci scharakteryzowano esterazy kwasu ferulowego,

ksylanazy i acetyloesterazy. Przedstawiono stan bada nad pozyskiwaniem kwasu ferulowego z

wysłodzin piwowarskich i innych materiałów ro linnych, po zastosowaniu oczyszczonych enzymów lub

preparatów enzymatycznych pochodzenia mikrobiologicznego. Wysłodziny piwowarskie s

najcenniejszym produktem odpadowym przemysłu piwowarskiego, bogatym w cenne składniki

ywieniowe, np. białko, błonnik pokarmowy i kwasy tłuszczowe. Kwas ferulowy jest naturalnym, silnym

przeciwutleniaczem wyst puj cym pospolicie w ziarniakach ro lin Graminaceae i w produktach

ubocznych przemysłu piwowarskiego – w wysłodzinach piwowarskich. Mo e by on przekształcany na

drodze mikrobiologicznej do innych zwi zków wykorzystywanych przemysłowo, np. przeciwutleniacza

kwasu kawowego lub waniliny, cenionego zwi zku aromatycznego ywno ci.

Słowa kluczowe: kwas ferulowy, esteraza kwasu ferulowego, ksylanaza, acetyloesteraza, wysłodziny,

piwo

Wst p

Wysłodziny powstaj ce w czasie zacierania słodu s najcenniejszym ubocznym

produktem przemysłu piwowarskiego. Od wielu lat trwaj prace nad ich

przemysłowym wykorzystaniem. Materiał ten zawiera cenne składniki ywieniowe,

takie jak białko, błonnik pokarmowy i kwasy tłuszczowe. Przeci tny skład wysłodzin,

w odniesieniu do suchej masy, jest nast puj cy: 20–30% arabinoksylanów, ok. 44%

innych polisacharydów nieskrobiowych i ok. 24% białka. Inne składniki wysłodzin

wyst puj ce w mniejszych ilo ciach to: celuloza (17%), lipidy (6%), ligniny (4%),

zwi zki mineralne i niewielkie ilo ci skrobi (< 2%) [1]. Podany przeci tny skład

wysłodzin jest zmienny i zale ny m.in. od przebiegu procesu zacierania słodu i od

Dr in . D. Szwajgier, prof. dr hab. Z. Targo ski, Katedra Technologii Przemysłu Rolno-Spo ywczego

i Przechowalnictwa, Akademia Rolnicza, ul. Skromna 8, 20-704 Lublin

Dominik Szwajgier, Zdzisław Targo ski

gatunku słodu [53]. Arabinoksylany wyst puj ce w wysłodzinach wyst puj w formie

ła cuchów b-1,4-ksylanopiranozowych, w których reszty ksylozowe podstawione s

przez reszty arabinozowe w pozycji C2 (około 17% reszt ksylopiranozowych), C3 (7%

reszt ksylopiranozowych) lub te w obu pozycjach (około 16% reszt

ksylopiranozowych). Wi kszo reszt a-L-arabinofuranozowych wyst puje w formie

monomerowych ła cuchów bocznych, podczas gdy niewielka ich liczba tworzy krótkie

ła cuchy boczne według schematu Araf-Araf-Xylp-Araf [52]. Reszty kwasu

ferulowego tworz wi zanie estrowe z grup arabinofuranozydow w pozycji 5-O [46].

Przeci tna zawarto kwasu ferulowego w wysłodzinach wynosi około 0,32% suchej

masy. Od wielu lat poszukuje si jak najlepszych i najwydajniejszych sposobów na

zagospodarowanie przemysłowe wysłodzin. Wynikiem tych prac jest du a liczba

patentów dotycz cych tej problematyki. Wa nym sposobem zagospodarowania

wysłodzin jest wykorzystywanie ich jako paszy [44]. Inne kierunki zagospodarowania

to wytwarzanie z wysłodzin preparatów od ywczych o du ej zawarto ci

przyswajalnego białka [31, 32, 33] oraz wytwarzanie biogazu [16].

Celem przegl du było przedstawienie stanu bada nad pozyskiwaniem kwasu

ferulowego z wysłodzin piwowarskich po zastosowaniu oczyszczonych enzymów lub

preparatów enzymatycznych pochodzenia mikrobiologicznego, jak równie

scharakteryzowanie enzymów grzybowych i bakteryjnych wykazuj cych aktywno

hydrolityczn w stosunku do polisacharydów nieskrobiowych.

Charakterystyka enzymów pochodzenia mikrobiologicznego bior cych udział

w degradacji polisacharydów nieskrobiowych

W wielu pracach badawczych, w ci gu ostatnich kilkudziesi ciu lat,

scharakteryzowano aktywno esterazy kwasu ferulowego, acetyloesterazy i ksylanazy

produkowanych przez szczepy ró nych drobnoustrojów. Wymienione enzymy s

wytwarzane przez drobnoustroje w celu degradacji hemiceluloz wchodz cych w skład

cian komórkowych ro lin wy szych. Esterazy pochodzenia mikrobiologicznego

zwi kszaj stopie degradacji głównych ła cuchów polisacharydowych ciany

komórkowej poprzez usuwanie bocznych grup, które chroni dost p do ła cucha

głównego.

Zastosowanie oczyszczonej ksylanazy lub esterazy kwasu ferulowego w czasie

przerobu wysłodzin wi e si ze znacznie podwy szonymi kosztami. Wykorzystanie

mikrobiologicznych preparatów enzymatycznych o wielokierunkowej aktywno ci

w stosunku do frakcji hemicelulozowych umo liwia obni enie kosztów ich utylizacji

i uzyskiwania cennych półproduktów wykorzystywanych przemysłowo, takich jak

kwas ferulowy [6]. Przykładowo, badano zdolno preparatów enzymatyczych

Ultraflo, Viscozyme, Termamyl i Lallzyme do uwalniania kwasu ferulowego

i kumarowego z wysłodzin piwowarskich [8]. Spo ród czterech wymienionych

preparatów enzymatycznych, jedynie preparat Termamyl nie wykazywał aktywno ci

esterazy kwasu ferulowego. Preparat Ultraflo najskuteczniej uwalniał wolny kwas

CHARAKTERYSTYKA ENZYMÓW POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO...

ferulowy i kumarowy w st eniu wynosz cym odpowiednio 70% wolnego kwasu

ferulowego i 8% p-kumarowego w odniesieniu do całkowitej zawarto ci tych kwasów

w wysłodzinach poddanych do wiadczeniu. Preparaty Viscozyme i Lallzyme uwolniły

w tych samych warunkach odpowiednio 33 i 55% kwasu ferulowego. Preparat Ultraflo

L, przejawiaj cy głównie aktywno b-glukanazy oraz wiele pobocznych aktywno ci

hemicelulaz produkowanych przez Humicola insolens wykazywał aktywno esterazy

kwasu ferulowego w stosunku do metylowych pochodnych kwasu cynamonowego

i miał zdolno uwalniania 65% kwasu ferulowego obecnego w formie monomeru oraz

trzech form kwasu dehydrodiferulowego z wysłodzin browarniczych [23].

Zastosowanie preparatu Ultraflo L nie wykazuj cego aktywno ci esterazy kwasu

ferulowego znacznie podnosiło zdolno (z 23 do 47%) oczyszczonej esterazy kwasu

ferulowego wyprodukowanej przez grzyby Aspergillus niger do uwalniania kwasu

ferulowego z młóta browarniczego, zwłaszcza w formie 8,5'-benzofuranowej.

Współdziałanie preparatu Ultraflo L i esterazy kwasu ferulowego nie powodowało

uwolnienia całej zawarto ci kwasu ferulowego z wi za estrowych, co sugeruje, e do

uwolnienia dimerowych form kwasu ferulowego w arabinoksylanach z wysłodzin

piwowarskich niezb dny jest kompleks enzymatyczny o bogatej aktywno ci hydrolaz.

Mo liwe tak e, e nale y zwi kszy dost pno enzymów do reszt kwasu ferulowego,

rozmieszczonych w ła cuchu polisacharydów nieskrobiowych. W innych badaniach

wykorzystywano 9 handlowych preparatów enzymatycznych firmy Novo Nordisk

w celu uwalniania kwasu ferulowego, ramnozy, arabinozy i kwasu galakturonowego z

wysłodków buraczanych [38]. Preparaty enzymatyczne, wytworzone przy u yciu

szczepów z gatunków Aspergillus: aculeatus, niger, oryzae oraz rodzaju Trichoderma,

wykazywały aktywno ci hydrolityczne w stosunku do frakcji pektyn, ksylanów,

celulozy, b-glukanów, hemiceluloz i arabinanów zawartych w wysłodkach

buraczanych. Preparat enzymatyczny SP 342 uwalniał kwas ferulowy w formie wolnej

w pierwszych etapach procesu, podczas gdy w nast pnych godzinach procesu uwalniał

kwas ferulowy w formie estrów z sacharydami. Dwa inne preparaty enzymatyczne

o nazwach Glucanex i SP 506 uwalniały wolny kwas ferulowy, za pozostałe

6 preparatów enzymatycznych nie uwalniało kwasu ferulowego w formie wolnej.

Wszystkie preparaty enzymatyczne były zdolne do zwi kszenia st enia w roztworze

kwasu ferulowego zwi zanego z sacharydami, przy czym najwy sz aktywno ci

charakteryzowały si preparaty SP 584, SP 585 i SP 342, przy czym preparat SP 584

uwalniał w formie wolnej około 43% całkowitej zawarto ci kwasu ferulowego. Preparat

Pektolase LM uwalniał najpierw zwi zany estrowo kwas ferulowy, a nast pnie wolny

kwas ferulowy. Preparat SP 342 powodował jednoczesny wzrost st enia wolnego i

zwi zanego kwasu ferulowego w mieszaninie inkubacyjnej, co wiadczyło o zdolno ci

enzymów zawartych w tym preparacie do degradacji ła cuchów pektynowych w

formie natywnej. Preparat enzymatyczny SP 342 nie był jednak zdolny do uwalniania

kwasu ferulowego z niskocz steczkowych substratów powstałych po działaniu

preparatów SP 584 i SP 585. Preparat enzymatyczny SP 584 wykazał ponadto

zdolno do uwalniania dehydrodimerów kwasu fenolowego. Wyniki przedstawionych

Dominik Szwajgier, Zdzisław Targo ski

do wiadcze wiadcz o mo liwo ci wykorzystania opisanych grzybowych preparatów

enzymatycznych w celu uwalniania kwasu ferulowego w formie poł cze z estrami z

wysłodzin piwowarskich.

W badaniach nad uwalnianiem kwasu ferulowego z wysłodzin [14] uzyskano

wysokie st enie kwasu ferulowego w roztworze, si gaj ce 1,712 g w 1 kg s.m.

wysłodzin, co stanowiło 80% całkowitej zawarto ci kwasu ferulowego w wysłodzinach

u ytych do bada . Autorzy podkre lili, e najlepsze rezultaty osi gni to przy u yciu

preparatu enzymatycznego Ultraflo L. Maceracja wysłodzin za pomoc wodnych

roztworów etanolu nie zwi kszała stopnia uwalniania kwasu ferulowego z wysłodzin,

za autorzy stwierdzili, e mo liwe jest uwolnienie nawet do 80% całkowitej

zawarto ci kwasu ferulowego z wysłodzin bez stosowania etapów przygotowawczych

młóta. W innych pracach tak e szczegółowo opisano współprac ksylanazy z grzyba

rodzaju Trichoderma i esterazy kwasu ferulowego ze szczepu A. niger w uwalnianiu

kwasu ferulowego w formie wolnej z otr b zbo owych i odpadów buraka cukrowego

bogatych w hemicelulozy [22]. Podatno arabinoksylanów na degradacj pod

wpływem egzogennej, oczyszczonej endo-b-1,4-ksylanazy (E.C 3.2.1.8) z Aspergillus

awamori jest ci le uzale niona od stosunku zawarto ci arabinozy do ksylozy w

cz steczce. Je li stosunek ten wynosi około 0,4, cz steczki arabinoksylanów ulegaj

łatwo hydrolizie, je li natomiast wynosi 0,9 zachodzi bardzo ograniczona degradacja.

Nale y podkre li , e w obu przypadkach, niezale nie od omawianego stosunku

arabinoza : ksyloza, powstaj podobne krótkoła cuchowe fragmenty

oligoarabinoksylanów. Wyniki metylacji krótkoła cuchowych fragmentów

oligoarabinoksylanów wskazuj , e 55% reszt ksylopiranozowych w j czmieniu oraz

65% reszt ksylopiranozowych w słodzie wyst puje w poł czeniach z resztami

arabinofuranozowymi [54]. W porównaniu z arabinoksylanami j czmienia i słodu,

które nie zostały poddane działaniu endoksylanazy, uzyskane oligoarabinoksylany

charakteryzowały si wy szym stopniem podstawienia reszt ksylopiranozowych przez

arabinofuranoz w pozycji O-2 i O-2,3. Powtórna inkubacja otrzymanych

oligoarabinoksylanów z endoksylanaz wyprodukowan przez grzyby Aspergillus

awamori nie wywoływała dalszej hydrolizy cz steczek. Mo e to wskazywa na fakt

odcinania dost pu do ła cuchów oligoksylopiranozowych przez obecno du ej liczby

przył czonych reszt arabinofuranozowych i mo liwej obecno ci reszt kwasu

ferulowego. Ograniczona hydroliza oligoarabinoksylanów przez endo-b-1,4-ksylanaz

wyprodukowan przez szczep Aspergillus awamori mo e by wyja niona przez

zdolno wymienionego enzymu do rozszczepiania wi zania mi dzy resztami

ksylopiranozowymi tylko w sytuacji, gdy co najmniej dwie kolejne reszty

ksylopiranozowe w ła cuchu ksylopiranozowym nie s poł czone z reszt

arabinofuranozy. Z tego te wzgl du sekwencje dwóch niepodstawionych reszt

ksylopiranozowych musz by nieobecne lub rzadkie w przypadku opisywanych

oligoarabinoksylanów. Analogicznie, natywne arabinoksylany pochodz ce

z j czmienia i słodu musz zawiera fragmenty zło one z co najmniej czterech

CHARAKTERYSTYKA ENZYMÓW POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO...

niepodstawionych przez arabinofuranoz reszt ksylopiranozowych, poniewa jako

produkty inkubacji wyst puj : ksyloza, ksylobioza i ksylotrioza [54].

Zastosowanie oczyszczonego preparatu enzymatycznego o aktywno ci endo-b-

1,4-ksylanazy (E.C. 3.2.1.8) z hodowli Aspergillus awamori w celu degradacji

arabinoksylanów j czmienia i słodu powodowało wytworzenie oligomerów o stopniu

polimeryzacji poni ej DP 6, za oligomery o DP powy ej 6 wyst powały w niskich

st eniach [51]. Najwi kszy udział miały oligoarabinoksylany maj ce od 3 do 6 reszt

ksylopiranozowych. Podobnie, jak w przypadku arabinoksylanów z j czmienia i słodu

niepoddanych hydrolizie za pomoc endo-b-1,4-ksylanazy, równie po hydrolizie

arabinoksylanów wyst powały niewielkie ró nice w budowie uzyskanych oligomerów.

Na podstawie analizy miejsca podstawienia reszty ksylopiranozowej przez

arabinofuranoz w uzyskanych oligomerach mo na stwierdzi , e substytucja ksylozy

w pozycji O-2 o wiele silniej hamuje degradacj arabinoksylanów w porównaniu

z substytucj w pozycji O-3. Mo e to cz ciowo wyja nia ograniczon degradacj

arabinoksylanów w czasie słodowania, a nawet w czasie zacierania słodu. W zwi zku z

tym, dodatek samej endo-b-1,4-ksylanazy mo e by niewystarczaj cy do uzyskania

odpowiedniej degradacji arabinoksylanów w wysłodzinach.

W hodowlach prowadzonych przy u yciu szczepu A. niger CBS 120.49

w obecno ci wyizolowanego ksylanu owsianego, grzyb wytwarzał esteraz kwasu

ferulowego o masie cz steczkowej wynosz cej 36•10 3 Da [18]. Opisywana esteraza

kwasu ferulowego wykazywała aktywno enzymatyczn wobec metylowych

pochodnych kwasu cynamonowego charakteryzujacych si obecno ci grupy

metoksylowej w pozycji C3 pier cienia fenolowego, lecz nie powodowała hydrolizy

wi zania estrowego w poł czeniach metanolu i pochodnych kwasu benzoesowego.

Obecno grupy metoksylowej w pozycji C3 pier cienia cz steczki kwasu fenolowego

i nienasyconego ła cucha alifatycznego wydaje si by koniecznym warunkiem

działania omawianej esterazy. Enzym wykazywał tak e aktywno wobec octanu p-

nitrofenolu. Optymalna warto pH działania esterazy wynosiła 5,0 za optimum temp.

55–60 o C. Aspergillus niger produkował esteraz kwasu ferulowego w hodowlach

prowadzonych na wysłodkach z buraka cukrowego. Enzym wykazywał aktywno w

stosunku do ferulowanych arabinoksylanów o ró nej masie molowej i budowie [34].

Esterazy kwasu ferulowego produkowane przez ró ne szczepy A. niger mog

wykazywa zró nicowan zdolno odszczepiania wolnego kwasu ferulowego z

polisacharydów cian komórkowych okre lonych substratów. Np. aktywno esterazy

kwasu ferulowego wyst powała w hodowlach A. niger prowadzonych na wytłokach z

buraka cukrowego, arabanie z wysłodków buraczanych, otr bach pszennych, lecz

aktywno ci tej nie stwierdzono, gdy ródłem w gla była pektyna z buraka cukrowego

pozbawiona reszt kwasu ferulowego w formie estrowej [13].

Esteraza kwasu ferulowego mo e degradowa diferulowe poł czenia mi dzy

polisacharydami cian komórkowych. Szczegółowe badania nad esteraz kwasu

ferulowego produkowan przez grzyby A. niger wykazały, e enzym ten był zdolny do

hydrolizy trzech podstawowych wi za dehydrodiferulowych obecnych w cianach

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: