Ćwiczenie A

Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę ślinową – określenie optymalnej temperatury dla aktywności amylazy ślinowej.

Odczynniki:

- roztwór amylazy ślinowej

- 1% roztwór skrobi w temp. 20oC, 37oC i 45oC

- 0,0025% roztwór I2 w KI

Wykonanie:

    W czystej kolbie umieszczamy ślinę  (po wcześniejszym przepłukaniu ust ciepłą wodą                                    i wodą destylowaną). Następnie sporządzamy roztwór skrobi. Do 1 grama skrobi wlewamy
odmierzoną pipetą objętość wody destylowanej. W tym przypadku objętość ta wynosi              0,99 cm³. Całość umieszczamy w kolbie i mieszamy. Powstał nam 1% roztwór skrobi.
     Następnie w statywach umieszczamy trzy probówki. W każdej z nich umieszczamy odmierzoną pipetą 1 cm³ śliny i 9 cm³ wody destylowanej. Każdą z probówek przez 15 minut podgrzewamy w odpowiednich temperaturach. W tym przepadku probówkę nr 1 w 20 °C,            nr 2 w 37 °C nr 3 w 45°C. W międzyczasie sporządzamy roztwór jodu. Z 1 cm³ płynu Lugola i 100 cm³ wody destylowanej (wszystko odmierzamy pipetą). Roztwór ten umieszczamy w trzech innych probówkach niż roztwór śliny. Następnie do probówki z roztworem jodu dodajemy po 10 cm³ roztworu skrobi. Do roztworu jodu z dodatkiem skrobi dodajemy 1 cm³ śliny. Do każdej probówki z jodem i skrobią dodajemy  roztwór śliny o innej temperaturze.

Obserwacje:

    Za nim dodałam roztwór śliny do roztworu jodu ze skrobią w każdej z probówek pojawiło się granatowo niebieskie zabarwienie. Jest to reakcja charakterystyczna za pomocą której można wykryć zawartość skrobi np. w produktach spożywczych.
    W probówce gdzie roztwór śliny był podgrzany w 45 °C nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian. Zatem granatowo niebieskie zabarwienie pozostało.
    W probówce gdzie roztwór śliny był podgrzany w 37°C nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian. Zatem granatowo niebieskie zabarwienie pozostało.
    W probówce gdzie roztwór śliny był podgrzany w 20°C zaobserwowaliśmy, że granatowo niebieskie zabarwienie stopniowo zaczęło się
odbarwiać.

Wnioski:

    Amylaza ślinowa zawarta w ślinie tylko z probówki, która była podgrzana w 20°C rozłożyła wstępnie skrobię. Poznaliśmy to po tym, że granatowo niebieskie zabarwienie odbarwiło się.
    Amylaza ślinowa nie uległa denaturacji w 20°C a więc temperatura ta jest temperaturą optymalną, w której enzym ten wykazuje swą specyficzność. Czynnikiem denaturującym               w tym przypadku była zbyt wysoka temperatura podgrzania w pozostałych probówkach                 w wyniku czego straciły one swą specyficzność enzymatyczną.

Ćwiczenie B

Wykrywanie oksydaz w ziemniaku.

Odczynniki:

-          wyciąg ziemniaczany

-          1% roztwór fenolu

-          1% roztwór pirokatechiny

-          1% roztwór pirogalolu

-          1% roztwór Na2S

Wykonanie:

              Do trzech probówek wlać po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej probówki dodać 10 kropli 1% fenolu, do drugiej 10 kropli 1% pirokatechiny, do trzeciej 10 kropli 1% pirogalolu. Zawartość wymieszać i obserwować zmiany zabarwienia. Wykonać analogicznie ćwiczenie po dodaniu kropli 1% roztworu Na2S.

Obserwacje

1 probówka:

-          po 3 minutach kolor zmienił się na różowy

-          na powierzchni roztworu pojawiły się pęcherzyki gazu

2 probówka:

-          po 3 minutach kolor zmienił się na jasny brązowy

-          na powierzchni roztworu pojawiły się pęcherzyki gazu

3 probówka:

-          po 1 minucie kolor zmienił się na brązowy

-          na powierzchni roztworu pojawiły się pęcherzyki gazu

4 probówka:

-          po 4 min. nie zaobserwowałyśmy żadnych zmian, nie wydzielił się gaz

Wnioski:

              Po wykonaniu ćwiczenia mogłyśmy zauważyć, które roztwory są najsilniej działającymi, a które nie. W pierwszych trzech probówkach zaobserwowałyśmy zmianę koloru zabarwienia roztworów oraz pojawienie się pęcherzyków gazu na jej powierzchni. Natomiast w czwartej probówce nie zostały zaobserwowane żadne zmiany.

Z przeprowadzonego doświadczenia wynika, że najsilniej działającym odczynnikiem chemicznym jest roztwór 1% pirogalolu, ponieważ zabarwił on wyciąg ziemniaczany na kolor brązowy po upływie 1 min. Najsłabiej działającym odczynnikiem chemicznym okazał się 1% roztwór Na2S, ponieważ po upływie 4 min nie zaobserwowano żadnych zmian i nie wydzielił się gaz na jego powierzchni.

Ćwiczenie C

              Oksydaza fenolowa (katecholowa).

Odczynniki:

1)   (wyciąg) z bulwy ziemniaka

2)   4% NaCN

3)   bufor fosforanowy pH 7,4;

4)   1% roztwór pirokatechiny

Wykonanie:

Zawartość wszystkich probówek starannie wymieszano temperaturze postawiono                 w temperaturze pokojowej. Co minutę ,dla lepszego dostępu tlenu, probówki 1, 2, 3, 5 i 6 mocno wstrząsano. Próbki obserwowano przez 20 minut.

Obserwacje:

W probówce 1 i 4 roztwór przyjął ciemnobrunatne zabarwienie. W pozostałych próbach roztwór nie zmienił zabarwienia.

Wnioski:

W probówce 1 i 4 enzym-oksydaza fenolowa- zawarty e wyciągu ziemniaczanym utlenił pirokatechinę  co spowodowało zabarwienie roztworu na ciemnobrunatny kolor.

W probówce 2 brak pirokatechiny pokazał ze enzym oksydaza fenolowa nie reaguje               z wodą,

W probówce 3 nastąpiła inaktywacja enzymu pod wpływem inhibitora NaCN,

W probówce 5 wysoka temperatura spowodowała denaturację enzymu a tym samym pozbawienie go aktywności dlatego nie obserwujemy zmiany zabarwienia roztworu,

Roztwór w probówce 6 pozbawiony enzymu również nie zmienia barwy. Oznacza to, że do utlenienia pirokatechiny potrzebna jest oksydaza fenolowa

Ćwiczenie D

              Katalaza.

Odczynniki:

- wyciąg ziemniaczany;

- 4% NaCN

- 3% woda utleniona.

Wykonanie:

Próba 5: 5 ml wody, kilka kropli NaCN i 10 kropli H2O2.

Obserwacje:

W probówce 1 nastąpiło gwałtowne pienienie mieszaniny reakcyjnej. W pozostałych probówkach nie zaobserwowano pienienia.

Wnioski:

Gwałtowne pienienie w probówce 1 spowodowane było działaniem katalazy która rozkłada nadtlenek wodoru do wody i tlenu  który gwałtownie się ulatnia(stąd pienienie).

Katalaza jako enzym (czyli białko) jest wrażliwa na działanie wysokiej temperatury- spowodowała ona inaktywację enzymu w probówce 3.

Również obecność NaCN (probówka 2) powoduje inaktywację enzymu.

Próba 5 potwierdza, że obecność katalazy w roztworze warunkuje rozkład nadtlenku wodoru                         (w tym przypadku w roztworze nie było tego enzymu).

Ćwiczenie E

              Wykrywanie peroksydaz w ziemniaku.

Odczynniki

- wyciąg ziemniaczany;

- 1% roztwór fenolu;

- 1% roztwór pirokatechiny;

- 1% roztwór pirogalolu;

- 3% roztwór H2O2;

- 4% roztwór benzydyny

Wykonanie

                            Próba z fenolami:

              Do 3 probówek wlano po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej probówki dodano 10 kropli 1% fenolu, do drugiej 10 kropli 1% pirokatechiny, do trzeciej 10 kropli 1% pirogalolu, a następnie do każdej probówki wprowadziono dodatkowo po 10 kropli 3% roztworu H2O2. Zawartość probówek wymieszano i obserwowano zmiany zabarwienia.

Obserwacje:

              W 1 probówce nastąpiło odbarwienie koloru czewonego, w 2 i 3  probówce zaobserwowano pojawienie się barwy czerwonej

Wnioski:

              Działanie peroksydazy związane jest z obecnością H2O2. Nadtlenek wodoru nie jest rozkładany z wydzieleniem tlenu, lecz wykorzystywany przez enzym w reakcjach utlenienia fenolu;.

                            Próba benzydynowa:

                            Do 5ml wyciągu ziemniaczanego dodano kroplę 4% roztworu benzydyny (kolor jasnożółty)  i kilka kropli H2O2.

Obserwacje:

              Nastąpiło odbarwienie roztworu jasnożółtego na niebieski.

Wnioski:

              Benzydyna w obecności H2O2 ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego.

Ćwiczenie F

              Porównywanie wrażliwości oksydaz i peroksydaz na temperaturę.

Odczynniki:

- wyciąg ziemniaczany

- 1% roztwór pirokatechiny

- 3% roztwór H2O2

Wykonanie:

              Do dwóch probówek odmierzyć po 5 ml wyciągu ziemniaczanego przygotowanego                     w zadaniu 1. ogrzewać probówki na łaźni wodnej w temperaturze 70oC przez 10 min. Do jednej dodać 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, a do drugiej 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny i 10 kropli roztworu H2O2.

Obserwacje:

W próbówce z nr 1 roztwór zabarwił się na kolor jasno brązowy, zaobserwowałyśmy pojawienie się piany.

W próbówce z nr 2 roztwór zabarwił się na kolor ciemno brązowy

Wnioski:

W próbówce 1 po ogrzaniu roztwór stal się jasno brązowy, co świadczy o  słabym utlenieniu pirokatechiny przez oksydazy, a wynika to z faktu małej odporności tych enzymów na wysoka temperaturę.

W próbówce 2 zaobserwowano  zmianę zabarwienia, zabarwienia na ciemniejszy kolor brązowy wynika z powstania chinonów w wyniku utlenienia pirokatechiny co potwierdza fakt, że peroksydazy są mało wrażliwe na działanie wysokiej temperatury. Peroksydazy wykorzystują nadtlenek wodoru w reakcji utlenienia pirokatechiny.                         Nie zaobserwowano piany nad roztworem w probówce co świadczy o braku katalaz.

Ćwiczenie G

              Wykrywanie oksydazy ksantynowej w mleku.

Odczynniki:

- Mleko świeże;

- Mleko przegotowane;

- 0,5% roztwór aldehydu mrówkowego;

- 0,02% roztwór błękitu metylowego;

- Ciekła parafina.

Wykonanie:

...