Biotechnologia - Insulina.docx

INSULINA

Insulina – polipeptyd o masie około 6 kD, który jest wytworzony przez komórki β wysepek Langerhansa. Komórki α wysepek produkują antagonistyczny glukagon.

Działanie insuliny:

Insulina wiąże się z receptorami insulinowymi na powierzchni komórek insulinowych i aktywuje procesy wnikania i przerobu glukozy. Czas półtrwania insuliny w krwioobiegu wynosi 20 minut. Wydzielanie insuliny w organizmie jest procesem ciągłym, ale poziom glukozy w organizmie w ciągu doby się waha.

Budowa chemiczna insuliny:

- składa się z dwóch łańcuchów A i B połączonych dwoma mostkami disulfidowymi

- w łańcuchu A jest 21 aminokwasów, w łańcuchu B – 30.

- na końcu jest alanina – w insulinie wieprzowej. Przy 7A i 7B i 19A i 20B są Moski łączące łańcuchy

- pętla w łańcuch A między 6 i 11 aminokwasem

- insulina tworzy dimery, tetramery, heksametry – mogą tworzyć się większe agregaty

- łańcuchy niepołączone w mieszaninie nie mają aktywności biologicznej

Historia insuliny:

1890 – praca Meringa i Minkowskiego – stwierdzenie  że w krwi jest czynnik regulujący poziom cukru

1921 – młodzi lekarze wydzielili ten czynnik: Best i Banting (wyciąg z trzustki). W dwa lata po tym otrzymali nagrodę Nobla

1926 – Abel otrzymuje insulinę w stanie krystalicznym

1955 – Sanger ustala strukturę pierwszorzędową insuliny. Za metody sekwencjonowania peptydów – nagroda Nobla. Otrzymał w sumie dwa razy Nobla z dziedziny chemii.

1969 – przestrzenna struktura insuliny została odkryta

Lata 80 – odkrycie możliwości produkcji biotechnologicznej insuliny

Chemiczna metoda syntezy insuliny:

Łańcuchy bez problemu udało się zsyntezować. Problemem było dokładne połączenie łańcuchów w odpowiednich pozycjach. W końcu się to udało z użyciem peptydów sygnałowych, które później zostają wycięte.

Właściwości insuliny:

- rozpuszczalna w kwasach i zasadach

- pkt izoelektryczny przy pH=5,3, wtedy insulina wydziela się z roztworu i jest rozpuszczalna w rozcieńczonym alkoholu.

Problemem wydzielenia insuliny  z trzustek zwierzęcych są enzymy trawienne (trypsyna głównie), które rozkładają insulinę. Enzymy trawienne muszą być unieczynnione działaniem HCl, dopiero po tym może nastąpić ekstrakcja etanolem. Wyodrębnienie z ekstraktu odbywa się przez wysolenie i strącenie w punkcie izoelektrycznym. Dalsze oczyszczanie odbywa się przez krystalizację.

Etapy wydzielenia insuliny:

1.       Przy pH=2,5, w temp. 5oC materiał zwierzęcy poddaje się dwukrotnej ekstrakcji etanolem. Najpierw 95%, później 65%

2.       Oddzielenie zanieczyszczeń

3.       Zagęszczenie

4.       Oddzielenie tłuszczów i białek przez ogrzanie do temp. 35 – 50oC i filtrację

5.       Wysolenie insuliny z innymi proteinami i odfiltrowanie

6.       Rozpuszczenie w wodzie

7.       Doprowadzenie do pH=5,3, co powoduje ponowne strącenie insuliny

8.       Filtracja (odsączenie insuliny)

9.       Przemycie acetonem, eterem

10.   Wysuszenie pod zmniejszonym ciśnieniem

11.   Krystalizacja

Krystalizacja metodą Scotta:

Krystalizacja odbywa się z HCl 2,65%. Rozpuszcza się 75g insuliny w 3,24l tego kwasu. Doprowadza się buforem fosforanowym do pH=5,3, a następnie dodaje się 600ml acetonu, wtedy insulina krystalizuje.

Bufor: 402g Na2HPO4 12H2O + 66g KH2PO4 rozpuszczone w 24dm3 wody.

Metody otrzymywania insuliny w mikroorganizmach

1.       Metoda biotechnologiczno – chemiczna

Biosynteza łańcuchów w dwóch oddzielnych szczepach E. coli i łączenie ich metodami chemicznymi

2.       Metoda biosyntetyczna

Wykorzystuje bakterie E. coli, do których metodą plazmidową wprowadzono gen pro insuliny ludzkiej i doprowadzono do jego ekspresji, a następnie działaniem enzymów rozkłada się pro insulinę na insulinę i peptyd C.

Uproszczony przebieg biosyntezy insuliny w komórkach bakterii E. coli

3.       Semisynteza z insuliny wieprzowej

Polega na przetworzeniu insuliny wieprzowej w ludzką poprzez usunięcie końcowej alaniny (31) z łańcucha B i przyłączenie w jej miejsce treoniny. Wiązanie disulfidowe nie zostają naruszone. Tego rodzaju insulina nosi nazwę insuliny humanizowanej.

Preparat insulinowy:

- hormon (insulina)

- substancje przedłużające działanie insuliny (białka tworzące z insuliną kompleksy: protaminy np. salmina – białka uzyskiwane ze spermy łososia, zasadowe, zawierające wyłącznie alifatyczne aminokwasy argininy najczęściej. Pkt. Izoelektryczny powyżej 12)

- środki dezynfekujące (meta krezol lub fenol)

-   środki wspomagające krystalizację i bufory (cynk, na jeden heksametr insuliny dodaje się dwa atomy cynku, który wspomaga krystalizację i hamuje aktywność proteazy degradującej rozpad protaminy znajdującej się w tkankach i surowicy krwi co w efekcie spowalnia wydzielanie się insuliny)

Muteiny: białkowe substancje lecznicze mające inną sekwencję aminokwasów, wytworzone metodami inżynierii genetycznej.