Gospodarka azotowa

N w tkankach roślinnych – do 6% suchej masy.

Składnik aa, nukleotydów, bierze udział prawie we wszystkich reakcjach biochemicznych zachodzących w żywych organizmach, jego niedobór – częsty czynnik ograniczający tworzenie nowych tkanek.

Metabolizm N ściśle związany z metabolizmem C, ponieważ szkielety molekularne, do których N wbudowywany i energia potrzebna do tych procesów-  z metabolizmu C.

I.  Przemiany azotu w roślinach

1. Pobieranie N

N2 (którego w atmosferze jest około 78%) jest formą dla roślin niedostępną.

Głównymi formami N dostępnymi są NO3- i NH4+.

Z energetycznego punktu widzenia jony amonowe korzystniejsze – bo N już zredukowany i nie trzeba wydatkować energii na jego redukcję, jak to jest w przypadku azotanów. Ale dla roślin i tak najważniejszym źródłem N jest azotan.

Kilka słów wyjaśnień dlaczego azotan:

Istotny czynnik ułatwiający pobieranie jonów azotanowych – właściwości sorpcyjne gleby. Koloidy ilaste obecne w glebie wiążą kationy amonowe, natomiast aniony azotanowe pozostają w roztworze glebowym – są więc łatwiej dostępne.

Azotan reguluje aktywność enzymów asymilacyjnych – zatem to podwyższone stężenie tego jonu będzie prowadzić do zwiększenia aktywności enzymów włączających N, natomiast zwiększone stężenie amoniaku – nie.

Duże stężenie amoniaku może być toksyczne dla roślin.

W czasie pobierania amonu następuje znaczny spadek pH gleby, większość roślin źle to toleruje.

Poza tym w większości gleb amon jest szybko i tak utleniany do azotanu przez bakterie chemosyntetyzujące (Nitrosomonas i Nitrobacter).

Azotan pobierany jest na zasadzie transportu aktywnego, co wiąże się z wydatkowaniem energii, stąd w słabo przewietrzanych glebach i w niskiej temperaturze (niekorzystnie wpływa to na oddychanie) mogą wystąpić trudności z pobieraniem azotanów.

2. Asymilacyjna redukcja azotanów

Redukcja azotanów poprzedza ich właściwą asymilację, czyli redukcyjną aminację 2-oksokwasów (a-ketokwasów). 8 elektronowa redukcja, wymaga dużej ilości energii. Proces dwustopniowy.

Pierwszy etap – redukcja azotanu do azotynu.

Reduktaza azotanowa (NR) w cytoplazmie (roślina może mieć więcej niż jedną)

(u większości roślin jest to enzym, którego ekspresja indukowana obecnością azotanów, choć np. u roślin motylkowatych – występują także konstytutywne reduktazy)

Typowym donorem elektronów dla NR jest NADH (choć wykryto także w glonach i w korzeniach traw enzym mogący wykorzystywać NADH lub NADPH. W ogóle w korzeniach odkryto jeszcze co najmniej dwie, zupełnie inne reduktazy zdolne do redukcji azotanów, choć niektóre np. prawdopodobnie redukują azotan do NO).

NR: homotetramer zawierający po jednej cząsteczce FAD, hemu (cyt b557) i molibdenopteryny w każdej z 4 podjednostek. Jak przenoszone są elektrony przez ten łańcuch kofaktorów?

(NR – może występować też jako homodimer)

Rośliny pozbawione Mo nie są zdolne do przyswajania azotanów, bo reduktaza nie ma wszystkich kofaktorów (również hodowanie roślin na pożywce z wolframianem powoduje, że wolfram jest wbudowywany do reduktazy zamiast Mo i powstaje nieaktywny enzym)

NR jest jednym z niewielu enzymów roślinnych, których ekspresja jest regulowana egzogennym substratem. Rośliny posiadające indukowalną NR (a nie posiadające konstytutywnych) mają ten enzym tylko wtedy, gdy azotan jest obecny w podłożu. Azotan musi być także stale obecny, by poziom NR był utrzymywany na stałym poziomie, gdyż ten enzym ulega szybkiej degradacji. W wielu typach komórek kation amonowy jest represorem syntezy NR. Aktywność enzymu jest regulowana przez światło (powiązania z systemem fitochromowym (?) ja osobiście czytałam o regulacji poprzez fosforylację enzymu i jego wiązanie z innym białkiem, które zmienia jego aktywność, są także inne mechanizmy) Konieczność ścisłej regulacji NR jest ważna, ponieważ enzym ten tworzy azotyn, który jest dla komórki w większych stężeniach toksyczny (reaguje m.in. z hemem, aminokwasami, zasadami azotowymi) i musi być natychmiast przekształcany „dalej” do amonu przez kolejny enzym – reduktazę azotynową. Reduktaza azotynowa jest z kolei uzależniona od działającego łańcucha transportu elektronów (o czym później) i po ustaniu fotosyntezy – przestaje działać. Konieczne jest zatem wtedy natychmiastowe wyłączenie NR , żeby nie produkowała więcej azotynu, gdy niemożliwa jest natychmiastowa dalsza redukcja tegoż azotynu.

Wracając do samej NR– działa ona u części gatunków zarówno w pędach jak i w korzeniach a u części gatunków albo w pędach albo w korzeniach. Rośliny cienioloubne mają tendencję do redukcji azotanu w korzeniach, światłolubne – w liściach. Mogą występować różne izoformy enzymu. Stężenie NR jest w korzeniach pszenicy większe niż w pędach, ale aktywność NR w pędach 500x przewyższa aktywność enzymu z korzeni.

Drugi etap – redukcja azotynu do amonu

Reduktaza azotynowa (NiR) – kompletna redukcja azotynu do amoniaku

Jako donor elektronów do redukcji wykorzystuje ferredoksynę. Zredukowana ferredoksyna powstaje w wyniku działania fotosyntetycznego łańcucha transportu elektronów, dlatego też redukcja azotynów jest zależna od światła. W tkankach fotosyntetyzujących NiR występuje w chloroplastach.

W tkankach niefotosyntetyzujacych – w plastydach, zredukowana Fd ulega redukcji przez NADPH wytwarzany w oksydacyjnym szlaku pentozowym (u grzybów donorem elektronów zamiast Fd jest bezpośrednio NADPH).

NiR ma bardzo duże powinowactwo do azotynu i kilka a nawet kilkanaście razy większą aktywność od NR, co zapewnia szybką i wydajną redukcję produkowanego przez NR azotynu.

3. Asymilacja właściwa

Czyli włączanie do aminokwasów.

Głównym mechanizmem asymilacji azotu jest tzw. cykl GS-GOGAT – w ten sposób odbywa się przyswajanie co najmniej 90% jonów amonowych. Cykl GS-GOGAT wymaga więcej energii ale enzymy, które go przeprowadzają mają większe powinowactwo do swoich substratów, niż GDH do a-ketoglutaranu. Grupa -NH2 może być potem przenoszona z Glu na inne a-ketokwasy (pochodzące z metabolizmu węglowodanów) w reakcjach transaminacji – w ten sposób powstają inne aminokwasy.

4. Wydzielanie azotu. 

Rośliny oszczędzają swój azot. Tylko w śladowych ilościach mogą wydzielać go w postaci NH3. Niewielkie ilości aa mogą być wydzielane do gleby przez korzenie. Przed zrzuceniem liści część azotu jest z nich wycofywana. Trochę azotu roślina traci w owocach.

Azot z obumarłych części roślin jest wykorzystywany przez mikroorganizmy, które z powrotem przekształcają go do związków nieorganicznych.

II. Metabolizm azotowy mikroorganizmów

1. Organizmy wiążące N2

Prokariotyczne organizmy zdolne do wiązania atmosferycznego azotu są bardzo ważnym ogniwem obiegu azotu w przyrodzie.

Wiązanie azotu atmosferycznego polega na jego redukcji, w wyniku której powstają dwie cząsteczki amoniaku. Proces ten jest silnie endoergiczny.

(Azotobacter – na 1g związanego N2 zużywa 50 g glukozy, Clostridium – bakteria beztlenowa – aż 170 g)

Bakterie brodawkowe – dostarczają roślinie amoniak lub glutaminę, otrzymują związki węgla. Roślina zapewnia im też warunki rozwoju.

Przykłady organizmów zdolnych do wiązania azotu atm.

Organizmy symbiotyczne

- Rizobia: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium  (symbioza z roślinami motylkowatymi: łubin, wyka, koniczyna) – są najważniejszą grupą, jeśli chodzi o ilość wiązanego N2, brodawki korzeniowe i w łodydze,

- Frankia (Actinomycetes) (symbioza z np. olchą, drzewami, krzewami rosnącymi na glebach ubogich w azot), brodawki korzeniowe

- Azospirillum (Actinomycetes) trawy tropikalne – nie tworzą brodawek korzeniowych, tylko pozostają na powierzchni korzenia

-          symbiotyczne sinice Anabaena (symbioza z Azolla – paproć wodna, Cycas – sagowce)

-          roślina tropikalna Psychotria i Klebsiella rubicarum – brodawki liściowe,

Wolnożyjące:

-          sinice np. Anabaena, Nostoc

-          niektóre inne bakterie fotosyntetyczne: Rhodobacter, Rhodopseudomonas (względne tlenowce) Chromatium, Chlorobium (bezwzględne beztlenowce)

-          niefotosyntetyzujące bakterie: Azotobacter (bezwzględny tlenowiec), Klebsiella, Clostridium(bezwzględny beztlenowiec)

Udział w wiązaniu azotu znacznie mniejszy od symbiotycznych.

2. Bakterie brodawkowe

Zdolność do redukcji azotu jest u nich ściśle związana z symbiozą z roślinami motylkowatymi. Przez część cyklu życiowego bakt. brod. żyją w glebie jako saprofity, zdecydowana większość z nich nie ma wtedy zdolności wiązania N2. Zdolność ta jest uzyskiwana dopiero po wniknięciu przez włośniki do kory pierwotnej korzenia rośliny motylkowej i rozpoczęciu kooperacji z gospodarzem. Do komórek korzenia bakterie dostają się przez tzw. nić infekcyjną utworzoną przez roślinę z materiału ściany komórkowej . Kiedy nić infekcyjna dotrze przez włośnik do pierwszych warstw komórek korzenia, bakterie zostają z niej uwolnione do wakuol zwanych symbiosomami. Po infekcji bakterie dzielą się intensywnie, jednocześnie pobudzając komórki gospodarza do szybkiego wzrostu – powstają brodawki. W symbiosomach bakterie ulegają znacznym zmianom morfologicznym, przekształcając się z pałeczek w nieregularnie rozgałęzione formy zwane bakteroidami. Wniknięcie bakterii rozpoczyna ciąg procesów prowadzących do wiązania N2 i eksportu. Niezbędnym warunkiem jest wspólna koordynacja ekspresji genów gospodarza i bakterii oraz wymiana sygnałów pomiędzy nimi.

A jak to się zaczyna? Korzenie roślin motylkowych wydzielają do gleby (izo)flawonoidy, które u bakterii indukują ekspresję genów nod, kontrolujących proces tworzenia brodawek. Flawonoidy wydzielane przez różne gatunki roślin imdukują geny nod u różnych grup bakterii (rośliny strefy umiarkowanej np. koniczyna, groch wydzielają luteolinę i naryngeninę indukujące geny u Rhizobium, a soja – ze strefy tropikalnej, wydziela genisteinę i daidzeinę indukujące ekspresję genów u Bradyrhizobium). Prawdopodobnie szlak biosyntezy flawonoidów ulega modyfikacjom w obecności bakterii – skład flawonoidów w korzeniach zmienia się po inokulacji Rhizobium. Geny nod kodują białka odpowiedzialne za syntezę i transport cząsteczek sygnałowych zwanych czynnikami Nod, które inicjują organogenezę brodawek Czynniki Nod są oligosacharydami lipochitynowymi (N-acetylowane chitooligosacharydy), składają się z 3-5 monoacylowanych cząsteczek N-acetyloglukozaminy połączonych wiązaniami b-1,4. Podstawniki w szkielecie cukrowym decydują o specyficzności czynnika Nod względem gospodarza oraz wpływają na jego stabilność i aktywność biologiczną. Potraktowanie korzeni roślin motylkowatych nanomolowymi stężeniami oczyszczonych czynników Nod wywołuje kilka wczesnych reakcji brodawkowania (np. deformacja włośników korzeniowych, utworzenie merystemu brodawki, podziały komórek kortykalnych) – rozpoznanie sygnału Nod wyzwala u roślin tworzenie brodawki.

Synteza Nod – w wyniku ekspresji genów, których ekspresja indukowana flawonoidami. Bakteryjne geny brodawkowania można podzielić na tzw. wspólne – com (common) nod i specyficzne względem gospodarza - hsn (host-specific nodulation) nod. Wspólne nod występują u wszystkich gatunków bakt. brod. – oznacza się je: A, B, C i D. Nod D ulega konstytutywnej ekspresji w symbiotycznych  i wolnożyjących bakteriach wiążących N2 – białko Nod D jest aktywatorem transkrypcji pozostałych genów nod. Białka Nod z różnych gatunków bakterii wykazują bardzo duży stopień homologii, ale mogą oddziaływać tylko z określonymi flawonoidami. Nod D po związaniu flawonoidu ulega aktywacji – i aktywuje transkrypcję Nod A, B i C potrzebnych do syntezy czynników Nod – odpowiedzialne są one za syntezę głównego szkieletu łańcucha cukrowego , geny nod A, B, C znajdują się na dużym plazmidzie Rhizobium lub na „chromosomie” Azo- i Bradyrhizobium. Nod C – łączy monomery N-acetylo-D-glukozaminy, Nod B – odłącza grupę acetylową od nieredukującego końca cukru pozycji R3, zaś Nod A przyłącza w tym miejscu cząsteczkę kwasu tłuszczowego. Powstały łańcuch ulega dalszym modyfikacjom z udziałem białek stanowiących produkty genów hsn nod. Geny nod E i F decydują o długości łańcucha i stopniu nienasycenia kwasu tłuszczowego. Inne geny hsn kontrolują wprowadzanie do głównego łańcucha cukrowcowego specyficznych podstawników. Spora część z nich modyfikuje pozycję R1 na redukującym końcu cząsteczki. Czynniki Nod działają w niskich stężeniach (10-7-10-12 mola/dm3) i są bardzo specyficzne – stąd postuluje się obecność specyficznych receptorów u roślin. Pierwsze odpowiedzi na sygnał Nod można zaobserwować w komórkach włośników już po kilku minutach. Błona komórkowa ulega depolaryzacji, mniej więcej po 10 min pojawiają się pulsacje cytoplazmatycznego poziomu Ca2+, po nich następuje reorganizacja cytoszkieletu. W późniejszych stadiach rozwoju brodawki w odpowiedzi na zmniejszanie stężenia tlenu w jej wnętrzu aktywowane są inne klasy genów bakteryjnych: nif i fix. Inne białka kontrolują przebieg infekcji i wiązania N2.

W najwcześniejszych stadiach symbiozy, zanim dojdzie od wiązania N2 w epidermie korzeni zachodzi ekspresja wczesnych roślinnych genów nodulinowych ENOD, kodujących białka zwane wczesnymi nodulinami. Noduliny biorą udział w procesie infekcji i morfogenezie brodawek. Najwcześniej aktywowane geny kodujące peroksydazę i białka bogate w prolinę, prawdopodobnie wchodzące w skład ściany komórkowej nici infekcyjnej.. Białka kodowane genami ENOD – wiele różnych funkcji m.in. indukcja podziałów komórkowych, tworzenie zapory tlenowej brodawki zabezpieczającej nitrogenazę przez dostępem tlenu, transport Fe i Mo do bakteroidów. Jest też grupa genów jądrowych ulegających ekspresji dopiero, gdy rozwój brodawki zaawansowany – tuż przed rozpoczęciem i w trakcie wiązania N2 – tzw. późne geny nodulinowe NOD. Niektóre z powstających transkryptów oddziałują swoiście z komórkami zawierającymi bakteroidy, inne – z niezainfekowanymi. Kodują one leghemoglobinę (charakterystyczne białko brodawki) oraz enzymy (lub podjednostki) katalizujące asymilację wydzielanego przez bakterioidy amoniaku i transport powstających amidów lub ureidów. Rośliny motylkowe strefy umiarkowanej – np. koniczyna, bób – transportują głownie amidy, Gln i Asn. Motylkowate ze strefy tropikalnej – np. fasola, soja- transportują azot w formie ureidów –alantoiny, kwasu alantoinowego i cytruliny. Związki te powstają z puryn, które są syntetyzowane w komórkach zainfekowanych i utleniane w komórkach sąsiednich. Po dotarciu do pędu ureidy są przekształcane z wydzielaniem amoniaku włączanego ponownie do związków organicznych w cyklu GS-GOGAT. Najintensywniejsze wiązanie N2 – przed okresem kwitnienia gospodarza. Po kwitnieniu – natężenie wiązania słabnie, brodawki rozpadają się a bakterie wydostają się do gleby. Rośliny motylkowate najlepiej poznaną grupą roślin żyjących w symbiozie z bakteriami wiążącymi atmosferyczny azot – ze względu na ich szerokie wykorzystanie rolnicze (zielony nawóz – np. łubin, wyka, koniczyna; pasze), ale są także inne pary – roślina-bakteria (patrz wyżej, na koniec p.1).

Sinice – jeśli rosną na podłożu pozbawionym azotu. Nitkowate Anabaena, czy Nostoc tworzą w regularnych odstępach heterocysty – duże, grubościenne, wyspecjalizowane komórki pozbawione niektórych składników aparatu fotosyntetycznego – PSII) W heterocystach zachodzi wiązanie N2 z udziałem ATP i związków redukujących powstałych w wyniku fotosyntetycznego transportu elektronów. Sinice mogą być wolnożyjące, ale mogą też wchodzić w symbiozę z różnymi roślinami np. mchami, paprociami i roślinami nasiennymi. Próbowano stworzyć sztuczne układy symbiotyczne, z gatunkami roślin cennymi z rolniczego punktu widzenia, ale nie zakończyło się to powodzeniem.

3. Mechanizm wiązania azotu.

Podobny w różnych organizmach. Specjalny kompleks enzymatyczny – nitrogenaza. Składa się ona z dwóch enzymów, będących metaloproteinami. Obydwa białka udało się oczyścić i scharakteryzować.

Większe białko – zwane dinitrogenazą –lub białkiem MoFe zawiera miejsce redukcji N2. Heterotetramer - a2b2. Łączna masa cząsteczkowa 180-225 kDa w zal. od gatunku. Dwie pary nietypowych klastrów metalosiarkowych – pierwsza z tych par jest silnie związana z białkiem i występuje we wszystkich nitrogenazach – kompleks 8Fe-7S, atomy Fe związane 6 wiązaniami kowalencyjnymi z Cys białka. Druga para klastrów związana z białkiem znacznie słabiej i może ulec oderwaniu. W bakteriach wchodzących w związki symbiotyczne z roślinami np. Rhizobium i Bradyrhizobium – klastry te występują w postaci 1Mo-3Fe-3S i 4Fe-3S i są powiązane ze sobą 3ma dodatkowymi atomami S nieorganicznej. Atom Mo jest połączony z homocytrynianem. Nitrogenaza bakterii symbiotycznych zawsze zawiera Mo – zatem jest on niezbędny do symbiotycznego wiązania N2. Bakterie wolnożyjące w przypadku braku Mo, mogą go zastępować wanadem lub Fe. Powstające w ten sposób nitrogenazy alternatywne V-nitrogenaza i Fe-nitrogenaza słabiej redukują azot natomiast wytwarzają więcej H2.

Mniejsze białko – reduktaza dinitrogenazy, zwana też białkiem Fe, jest zbudowana z 2 identycznych podjednostek o masie 30-72 kDa, koordynujących symetrycznie pojedyncze centrum 4Fe-4S. Jego funkcją jest wiązanie ATP i dostarczanie elektronów dinitrogenazie.

Do działania dinitrogenazy konieczna obecność ATP i Mg2+.

Jak wygląda cykl pracy nitrogenazy?

1)     Białko Fe przyjmuje elektrony od zredukowanej Fd lub flawodoksyny (Fld)

2)     Następnie tworzy kompleks z dwoma Mg2+ i dwoma ATP.

3)     W tej postaci tworzy kompleks z białkiem MoFe i przekazuje mu elektrony. Redukcja białka MoFe jest sprzężona z hydrolizą związanego ATP. Białko MoFe ma także związaną w centrum aktywnym cząsteczkę N2

W dinitrogenazie elektrony najpierw ulegają akumulacji w klastrze żelazowym, a następnie zostają przekazane na klaster żelazowo-molibdenowy. W ten sposób powstaje aktywny enzym zdolny do wiązania i redukcji N2.

4) redukcja cząsteczki N2

(dzięki obecności Fe procesy zachodzące w białku MoFe i białku Fe można badać metodami spektroskopowymi – spektroskopią EPR oraz mössbauerowską. In vitro jako czynnika redukcyjnego używa się Na2S2O4 a N2 można zastąpić acetylenem lub cyjanowodorem – obydwa związki mają wiązanie potrójne. Redukcja acetylenu do etylenu jest reakcja charakterystyczną dla nitrogenazy i służy do oceny jej aktywności zarówno in vitro jak i in vivo).

Potrzebne 8krotne „obrócenie” się cyklu pracy nitrogenazy, by zredukować 1 cząsteczkę N2. Przez ten czas redukowana cząsteczka jest przytrzymywana w centrum aktywnym.

Wyizolowana nitrogenaza równolegle z redukcją N2 katalizuje wydzielanie H2

8H+ + 8e- + N2 -> 2NH3 + H2

W nienaruszonych komórkach wydzielanie wodoru jest zazwyczaj niewielkie, gdyż powstający H2 jest natychmiast rozkładany w reakcji odwrotnej (H2 -> 2H+ + 2e-) katalizowanej przez hydro...