1. MIKROSKOPIA ŚWIETLNA I POMIARY KOMÓREK.
Zasady prawidłowego oświetlenia wg. Kohlera:
- kolektor lampy odtwarza obraz źródła światła w płaszczyźnie przesłony tęczówkowej kondensora
- przesłona tęczówkowa lampy reguluje szerokość wychodzącej wiązki światła
- przesłona kondensora reguluje jasność obrazu
- średnica świetlnego pola musi być dostosowana do pola widzenia okularu
Granice rozdzielczości:
Oko – 0,2 mm (200nm)
Świetlny- 200 nm
Elektronowy- 0,2 nm
Zdolność rozdzielcza: wzór:.....
>> określana w jednostkach dł. Jako najmniejsza odległość dwóch struktur dających się odróżnić w obrazie mikroskopu jako 2 oddzielne struktury (punkty)
>> zdolność ta jest zależna od apertury numerycznej obiektywu>> im jest wyższa tym większa jest zdolność rozdzielcza i siła światła
>> graniczna wartość zdolności rozdzielczej zależna jest od długości używanej do badania fali świetlnej i wynosi 0,2 nm
>> dla światła niebieskiego (dł. Fali 0,5 nm) granica zdolności rozdzielczej wynosi 0,17 nm, a dla ultrafioletu (dł. Fali 0,275 nm) około 0,08 nm.
>> graniczna szerokość przedmiotu dostrzeganego jeszcze w mikroskopie
Części optyczne: okulary, kondensor, obiektywy, urządzenie oświetlające
Części mechaniczne: tubus, rewolwer, stolik, makro i mikro śruby, statyw
OKULARY:
- odwraca, powiększa, daje obraz urojony
- przekazują w powiększeniu do oka obraz pośredni preparatu
- korygują szczątkowe aberracje
- umożliwia prowadzenie pomiarów
- składają się z przynajmniej dwóch soczewek płaskowklęsłych, które są zwrócone powierzchnią płaską ku górze
- obie soczewki sa umieszczone w odległości równej połowie sumy ich długości ogniskowych
- soczewka oczna (górna) powiększa obraz, zbierająca (dolna) zmniejsza obraz rzeczywisty i czyni go bardziej wyraźnym
OBIEKTYWY:
- składają się z kilku ściśle połączonych ze sobą soczewek
- obraz jest powiększony, odwrócony i rzeczywisty
- cechy wygrawerowane na obudowie>> apertura numeryczna i skala powiększenia
Obiektywy suche>> między dolną soczewką a preparatem znajduje się powietrze
Obiektywy imersyjne>> między dolną soczewką a preparatem znajduje się płyn
HJ – czarny pierścień - olejek imersyjny
Glyc – czerwony pierścień – imersja glicerynowa
WJ – biały pierścień – imersja wodna
Rodzaje korekcji aberracji:
- Achromaty >> w jednym ognisku łączą się promienie światła czerwonego i niebieskiego... zielonego... filtr żółty
- Apochromaty>> promienie światła czerwonego, niebiesko-zielonego, niebiesko-fioletowego
- Plan>> niwelują także tzw. Wypukłość obrazu
KONDENSOR:
- służy do skupiania promieni świetlnych
- jest to ruchomy , specjalny układ soczewek oprawionych w metalowy pierścień i umieszczonych pod stolikiem
- daje on bardzo zbieżną wiązkę światła i eliminuj prawie całkowicie promienie rozbieżne
- w celu ograniczenia dopływu światła stosuje się przesłony- blendy umieszczone nad źródłem światła
- przy mniejszym powiększeniu obniżony przy wyższych podniesiony pod stolik> bardziej skupiona wiązka światła
URZĄDZENIE OŚWIETLAJĄCE:
- oświetlacz halogenowy o mocy 20 W z regulacją natężenia światła
Typy oświetlenia:
- ośw. Jasnego pola
- ośw. Ciemnego pola
- >>> w obrębie tych typów >>> oświetlenie padające i ośw. Przechodzące
Jasne pole przy świetle przechodzącym:
- najczęściej stosowany w badaniach
- wiązka światła biegnąca od źródła światła zostaje odbita przez zwierciadło mikroskopu do kondensora>> przechodzi przez preparat>> obiektyw>> okulary>> do oka
- obraz powstaje dzięki przezroczystości preparatu, który absorbuje część światła
Ciemne pole:
- różnica w kondensorze, który w szczególny sposób oświetla badany obiekt
- do obiektywu wpadają wyłącznie promienie ugięte na strukturach obiektu, a nieugięte są eliminowane
- struktury rozpraszające światło są widoczne jako jasno świecące struktury na ciemnym tle
Mikroskop fluorescencyjny:
- modyfikacja mikroskopu świetlnego
- preparaty sporządzane przy użyciu odczynników dających efekt fluorescencji >> przeciwciała znakowane znacznikami fluorescencyjnymi np. FITC , TRITC
- preparat oświetlany jest światłem pobudzającym fluorescencję
- światło emitowane przez znacznik jest zawsze o większej długości fali
- światło pobudzone jest absorbowane przez odpowiedni filtr
- obraz nieostry bo jest KONWOLUCJA >> nakładanie się promieni pochodzących z ugięcia na strukturach leżących w warstwach niżej lub wyżej niż płaszczyzna ostrego widzenia na obraz leżący w płaszczyźnie ostrego widzenia
Mikroskop konfokalny:
- promień laserowy skanuje badany obiekt uginając się na jego strukturach
- skanowanie sterowane jest przez układ ruchomych luster
- promienie świetlne biegną do fotopowielacza
- przed nim znajduje się przesłona, która filtruje promienie światła wychodzące z innych płaszczyzn badanego obiektu niż płaszczyzna ostrego widzenia
- informacje dotyczące poszczególnych punktów obrazu przekazywane są do komputera
- program komputerowy pozwala na odtworzenie trójwymiarowej struktury obiektu
- obraz ostry dzięki DEKONWOLUCJI
Mikrometr okularowy – okular z podziałką, w którym wyznaczono absolutną wartość (tzw. Wartość mikrometryczną) w jednostkach długości odstępu dwóch kolejnych kresek w podziałce dla danego obiektywu w mikroskopie. >>>odległości między kreskami nie są wykalibrowane /wyskalowane
Mikrometr przedmiotowy – szkiełko przedmiotowe, na którym wyryta jest podziałka. Odległość między dwiema kolejnymi kreskami (najmniejszymi) podziałki wynosi 10 nm.
- umieścić mikrometr przedmiotowy na stoliku i nastawić ostrość na podziałkę
- obraz podziałki podobnie jak obraz innych przedmiotów powstaje w płaszczyźnie przesłony okularu
- w okularze pomiarowym w płaszczyźnie przesłony okularu umieszczona jest podziałka
- patrząc w okular widoczne są obie podziałki
- ustalić liczbę kresek mikrometru przedmiotowego i okularowego dokładnie się pokrywajęcych
WM = 10 nm. X liczba podziałek (kresek) mikrometru przedmiotowego
Liczba podziałek (kresek) mikrometru okularowego
[nm]
Rzeczywista wielkość struktury
W. rzeczyw. = ilość podziałek x wartość mikrometryczna [nm]
· Detekcja białek metodą immunocytochemiczną:
- utrwalenie mikrotubul
- przerwać ciągłość błony kom.
- wprowadzić znaczniki za pomocą przeciwciał
- naświetlanie preparatu
- emisja światła o wyższej długośći fali
- obrazy nie do końca ostre >> konwolucja.
2. TECHNIKI I METODY STOSOWANE W BK
Mikroskop świetlny (pow. X 400) – barwienie hematoksyliną i eozyną
HEMATOKSYLINA – niebieski barwnik o charakterze zasadowym służący do wybarwiania kwasowych (bazowfilnych) struktur komórek np. jądra komórkowe >>> produkt bezbarwny pod wpływem utleniania zamienia się w barwną hemateinę
· hematoksylina żelazista – bejcowanie solami żelaza> hematoksylina łączy się z tymi strukturami które mają jony Fe 3+
· hematoksylina Ehrlicha – barwienie w punkcie końcowym (ałun potasu)
EOZYNA – różowy barwnik o charakterze kwasowym służący do wybarwiania zasadowych (acidofilnych ) struktur np. cytoplazmy >>> słaby kwas z 4 cząsteczkami bromu reaguje na aniony
Barwniki fluorescencyjne>> w mikroskopie fluorescencyjnym
- fluoresceina (na zielono) >> mikrotubule
- rodamina (na czerwono) >> centromery
- DAPI (na niebiesko) >> DNA i chromosomy
TEM – mikroskop transmisyjny elektronowy >>> wiązka elektronowa>> ogniskowane przez cewki magnetyczne >> zatopić w żywicy>> pociąć na skrawki
SEM – mikroskop skaningowy elektronowy>>> materiał pokrywamy cienką warstwą metalu ciężkiego>> skanowanie >cewki elektromagnetyczne
AUTORADIOGRAFIA – metoda pozwalająca wykryć w komórce lub tkance związek radioaktywny przy użyciu emulsji światłoczułej
Służy do:
- lokalizacji miejsca syntezy danego związku radioaktywnego>> czasu jego trwania>> drogi transportu
1. wprowadzenie prekursora
2. preparat na szkiełko
3. zanurzenie w roztworze emulsji światłoczułej >wytworzy się cienka błona światłoczuła reagująca na promieniowanie izotopu jak klisza fotograficzna
4. znakowanie nad preparatem >> można zabarwić inne elementy innym barwnikiem
>> synteza DNA – o tym świadczą kropki nad preparatem na błonie światłoczułaj
poziom szkiełka>> preparat z prekursorem>> emulsja światłoczuła>> ziarna srebra (czarne)
* jeśli seria preparatów z tymidyną – to znakowanie nad jądrem... jeśli użyty prekursor aminokwasów – to lokalizacja w cytoplazmie i droga ścieżką wydzielniczą
RNA – 3H – urydyna
DNA- 3H – tymidyna
DNA i RNA – 3H - cytydyna
Preparatyka:
- wprowadzenie izotopu za pomocą iniekcji lub inkubacji do żywego organizmu
- wykonanie preparatu i pozostawienie go na czas ekspozycji w ciemności
- wywołanie preparatu >> znakowanie występuje nad preparatem
Metody immunocytochemiczne = immunodetekcja
- wykorzystują one metody wiązania antygenu do przeciwciała>> produkowane przez limfocyty>> wiążą ściśle określony antygen>> składają się z 2 łańcuchów lekkich i 2 ciężkich >> mają zatem 2 miejsca wiązania antygenu
Odp. POLIKLONALNA – 1 antygen – kilka klonów limfocytów B
Odp. MONOKLONALNA – 1 antygen – klon limfocytów B
* przeciwciało > 1 antygen 1antygen>wiele przeciwciał
Klasy przeciwciał : IgA, IgD, IgE, IgG, (<<najczęściej stosowany) IgM (podział na podstawie różnicy budowie łańcuchów ciężkich)
PRZYGOTOWANIE PREPARATU:
1- Utrwalanie – zachować strukturę komórki; utrwalenie antygenu w niezmienionym miejscu i stanie pozwala na rozpoznanie go przez przeciwciało>> utrwalacze: aldehydy, alkohole, aceton, kwasy, zw. Metali ciężkich > dostosowane do trwałości badanych struktur
2- Zatapianie – przesycanie substancją utwardzającą; pozwala na krojenie materiału
Parafina>> m. Świetlny >> oziębiamy
Żywica>> m. Elektronowy>> podgrzewamy > by utwardzić
3- Krojenie- za pomocą mikrotomu, ultramikrotomu, kriostatu
4- Nakładanie na szkiełko >> podstawowe (MŚ) lub siatkę (ME)
5- Barwienie i kontrastowanie
Metody wykrywania antygenu:
- bezpośrednia >> przeciwciała swoiste dla danego antygenu są wyznakowane
- pośrednia >> stosuje się przeciwciała swoiste I (niewyznakowane) >> tworzy się kompleks: przeciwciało I – antygen; a następnie przeciwciało II (wyzna...
bzdetsterta