Chromatografia metalopowinowactwa.pdf

Materiały do ćwiczenia 4.

Metody chromatograficzne w oczyszczaniu białek.

Chromatografia metalopowinowactwa.

Podstawą chromatografii metalopowinowactwa (IMAC – I mmobilized M etal

A ffinity) jest fakt, że białka posiadają liczne reszty funkcyjne, które mają zdolność

kompleksowania jonów metali przejściowych (i nie tylko) – są to grupy tiolowe Cys,

imidazolowe His, karboksylowe Glu i Asp oraz fenolanowe Tyr.

Rys. 1 Schemat oczyszczania przy u yciu chromatografii metalopowinowactwa.

Złoże do oczyszczania w systemie IMAC powinno być zbudowane z hydrofobowego

polimeru posiadającego powierzchniowe hydrofilowe grupy zapewniające jego zwilżalność,

np. agaroza, celuloza. Złoże IMAC powinno być tak zmodyfikowane chemicznie, aby

posiadało zdolność chelatowania jonów metali przejściowych, które stanowią właściwe

ligandy oddziałujące z białkami. Ważne jest, aby chelatowanie jonów metali było na tyle

silne, żeby nie następowało ich wymywanie podczas procesu oczyszczania. Wyróżniamy trzy

złoża opracowane dla układu IMAC:

IDA-agaroza (ang. i mino d i a cetate) – złoże agarozowe posiadające jako grupy

aktywne reszty kwasu iminodioctowego. Grupa ta stosunkowo słabo chelatuje

jony metali, ponieważ posiada tylko trzy ligandy zdolne do kompleksowania.

Chelatowany jon metalu w geometrii oktaedrycznej posiada aż trzy wolne miejsca

koordynacyjne, które potencjalnie mogą służyć do wiązania oczyszczonego biała

(rys. 2). IDA jest grupą wywierającą niewielki efekt steryczny na pozostałe wolne

miejsca koordynacyjne jonu metalu – w efekcie obniża to selektywność wiązania

oczyszczanych białek.

Rys. 2 Schemat z o a IDA.

ł ż

X ➞ wolne miejsce koordynacyjne jonu metalu zdolne do kompleksowania z

resztami bia ka.

Me ➞ chelatowany przez z o e jon metalu, np. Ni

ł ż 2+

TED-agaroza (ang. t ris(carboxymethyl) e thylene d iamine) – złoże agarozowe

posiadające jako grupę chelatującą jony metali

tris(karboksymetylo)etylenodiaminę. Grupa ta posiada pięć miejsc ligandowych

zdolnych do chelatowania jonu metalu. Powoduje to, że złoże TED silnie wiąże

jony metali i w efekcie nie następuje wypływ jonów podczas oczyszczania.

Chelatowany przez TED jon metalu w układzie oktaedrycznym posiada wolne

tylko jedno miejsce koordynacyjne (rys.3). Wynikiem tego jest mniejsza

pojemność złoża TED niż złoża IDA. TED jest złożoną grupą przestrzenną

wywierającą silny efekt steryczny na wiązanie białka przez jon metalu – złoże

TED jest znacznie bardziej selektywne od złoża IDA.

Rys. 3 Schemat z o a TED.

ł ż

X ➞ wolne miejsce koordynacyjne jonu metalu zdolne do kompleksowania z

resztami bia ka.

Me ➞ chelatowany przez z o e jon metalu, np. Ni

ł ż 2+

NTA (ang. n itrilo t ri a cetic acid) – złoże agarozowe zawierające jako grupę

chelatującą jon metalu reszty kwasu nitrylotrioctowego. NTA posiada cztery

miejsca ligandowe chelatujące jony metalu. Związany przez złoże jon metalu

zachowuje jeszcze dwa miejsca koordynacyjne wolne (rys.4). Oznacza to, że jest

to złoże pośrednie w własnościach pomiędzy IDA a TED, wykazujące dużą siłę

wiązania jonów metalu oraz stosunkowo dużą pojemność. Podstawową wadą

tego złoża jest wysoki koszt jego syntezy w stosunku do IDA i TED.

Rys. 4 Schemat z o a NTA.

ł ż

X ➞ wolne miejsce koordynacyjne jonu metalu zdolne do kompleksowania z

resztami bia ka.

Me ➞ chelatowany przez z o e jon metalu, np. Ni

ł ż 2+

Selektywność układu oczyszczającego w chromatografii metalopowinowactwa można

uzyskać poprzez przyłączenie do oczyszczanego białka domeny fuzyjnej zawierającej kilka

występujących kolejno po sobie reszt aminokwasowych tworzących kompleksy z jonem

metalu. W tym momencie pojedyncze reszty aminokwasowe występujące na powierzchni

białek będą znacznie słabiej wiązane ze złożem. Białko hydrofobowe zawierające na

powierzchni wyeksponowaną do otoczenia domenę fuzyjną zawierającą ciąg aminokwasów

chelatujących będzie wypierać z kompleksów z jonami metali inne białka wiążące się

znacznie słabiej. Z aminokwasów występujących w białkach, zdolnych do kompleksowania

jonów metali, tylko histydyna i tyrozyna nadają się do konstrukcji domen fuzyjnych. Wynika

to z tego, że aminokwasy te w warunkach fizjologicznych nie są obdarzone ładunkiem i nie

mają zdolności do tworzenia wiązań kowalencyjnych z innymi resztami występującymi w

białku – gwarantuje to minimalny wpływ domeny fuzyjnej na aktywność oczyszczanego

białka. Domena fuzyjna w postaci aminokwasów kwaśnych nadawałaby białku silny

wypadkowy ładunek, który znacznie wpłynąłby na rozpuszczalność i aktywność

oczyszczanego białka; domena fuzyjna w postaci reszt cysteiny mogłaby wpłynąć na strukturę

hybrydu poprzez tworzenie mostków disiarczkowych z cysteinami występującymi w łańcuchu

peptydowym oczyszczanego białka.

W celu wybrania jonu metalu do systemu IMAC można posłużyć się teorią miękkich i

twardych kwasów i zasad. Zgodnie z tą teorią miękkie zasady najchętniej oddziałują z

twardymi zasadami tworząc układy jonowe. Histydyna zawierająca pierścień imidazolowy

jest stosunkowo miękką zasadą i będzie tworzyć trwałe termodynamicznie kompleksy z

miękkimi kationami metali, np. Co 2+ , Ni 2+ czy Zn 2+ . Właśnie te trzy jony metali stosuje się

jako ligandy złoża wiążące białka fuzyjne zawierające domeny polihistydynowe (His 6 rzadziej

His 10 ) lub mieszane histydynowo-tyrozynowe w chromatografii metalopowinowactwa IMAC.

Warunki prowadzenia oczyszczania:

wszystkie bufory stosowane do oczyszczania powinny zawierać wysokie stężenie

soli

(0,5 M NaCl). Niweluje to niespecyficzne oddziaływania jonowe ujemnie

naładowanych reszt aminokwasowych ze złożem, nie wpływa natomiast na

tworzenie kompleksów metalu – His lub Trp, ponieważ mają one charakter

bardziej kowalencyjny;

wszystkie bufory powinny mieć pH powyżej punktu izoelekrycznego histydyny

tak, aby nie następowało protonowanie reszt His;

elucji związanego białka można dokonać za pomocą kompetytora – imidazolu o

wysokim stężeniu (0,5 M) lub poprzez protonację histydyn przez obniżenie pH do

5,9;

następujące związki nie mają wpływu na wiązanie się białka fuzyjnego do złoża: 6

M chlorowodorek guanidyny, 8 M mocznik, 2% Triton X – 100, 2% Tween 20,

20 mM β-merkaptoetanol, 50% glicerol, 30% etanol, 2 M NaCl, 4 M MgCl 2 , 20

mM imidazol.

Wady i zalety metody:

domena fuzyjna typu His•Tag jest jedną z najmniejszych stosowanych obecnie

domen fuzyjnych w chromatografii powinowactwa – ok. 1 kDa. Powoduje to, że

wywiera ona nikły wpływ na aktywność oczyszczanego białka i nie ma

konieczności jej proteolitycznego odcinania;

stosowanie domen poli(His) pozwala na potwierdzenie oczyszczania w warunkach

natywnych i denaturujących;

układ ten pozwala nie tylko na oczyszczanie, ale i na silne zagęszczanie próbki ze

względu na dużą pojemność złoża;

systemy IMAC pozwalają na uzyskanie białka rekombinantowego o czystości

powyżej 90% w czasie krótszym niż 1 godzina;

podstawową wadą stosowania domeny fuzyjnej w postaci układu

polihistydynowego jest spowalnianie procesu translacji, co nieco osłabia ekspresję.

Źródło: Materiały do ćwiczeń z Biologii Molekularnej, Politechnika Gdańska.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: