stala michaelisa.pdf

Marian Kuczek

Department of Experimental and Molecular Biology,

University of Opole, Kominka 4, 45-035 Opole, Poland

Stała Michaelisa

W 1913 roku Leonor Michaelis i Maund Menten opisali zależność szybkości

reakcji katalizowanej enzymem inwertazą drożdżową od stężenia substratu, czyli od

stężenia sacharozy. Sacharaza, dawniej zwana inwertazą katalizuje reakcję

równowagową hydrolizy sacharozy.

W wyniku hydrolizy sacharozy, zmienia się skręcalność optyczna roztworu,

z prawoskrętnego staje się lewoskrętny, stąd pochodzi stara nazwa enzymu, inwersja

czyli odwrócenie.

W tamtych czasach można było badać aktywność optyczną stosunkowo

stężonych roztworów cukru. Jeżeli za miarę szybkości reakcji hydrolizy przyjmowano

szybkość zmiany kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego,

wówczas szybkość reakcji nie zależała od stężenia sacharozy i zależała wprost

proporcjonalnie od stężenia enzymu. Reakcje, których szybkość nie zależy od stężenia

substratu nazywa się reakcjami zerowego rzędu (patrz kinetyka reakcji chemicznych).

Wcześniej, Michaelis celem wyjaśnienia zerowego rzędu reakcji wysunął

przypuszczenie, że enzym z substratem wchodzi w reakcję równowagową tworząc

kompleks enzym - substrat, dalsze badania kinetyki tej reakcji powierzył Mount

Menten.

Menten, założyła, że reakcja hydrolizy sacharozy jest reakcją

pierwszego rzędu, czyli pominęła w swoich rozważaniach stężenie wody.

Podejście takie jest często stosowane w badaniach kinetycznych, gdyż

zużycie wody w roztworze wodnym podczas hydrolizy jest praktycznie

niezauważalne. Drugie uproszczenie, to ograniczyła się do badania szybkości

początkowej reakcji, czyli przyjęła:

1. Stężenie substratu nie zmienia się w wyniku powstawania kompleksu enzym

substrat (ES), oraz nie zmienia się w istotnym stopniu podczas przebiegu reakcji, czyli

reakcja biegnie ze stałą szybkością.

2. Zaniedbała szybkość reakcji odwrotnej, syntezy sacharozy z glukozy i fruktozy.

Szybkość reakcji.

Szybkością reakcji nazywamy pochodną stężenia substratu(ów) lub

produktu(ów) po czasie reakcji. Ze względów praktycznych zamiast równia

różniczkowego stosuje się równanie różnicowe a umownie nazywa się je różniczkowym.

d S

[ ]

Szybkość reakcji inwersji (hydrolizy) sacharozy Menten badała wagowo

i w przeciwieństwie do wcześniejszych badaczy mogła oznaczyć stężenia produktów

reakcji przy bardzo małych stężeniach sacharozy.

Wykonanie

W pierwszych latach ubiegłego stulecia stężenie cukrów redukujących badano

wagowo. W wyniku reakcji zasadowego roztworu soli miedzi 2 powstaje osad tlenku

miedzi 1. Osad ten odsączano, przemywano, suszono i ważono. Metoda ta była bardzo

pracochłonna. W 1944 roku opisano kolorymetryczną metodę oznaczania cukrów

redukujących i od tego czasu jest to najczęściej stosowania metoda.

Do kolejnych probówek dodaje się 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 3, 9 cm 3 0.2 M

roztworu sacharozy w 0.1 M buforze octanowym o pH 4.5, dopełnia się do 9 cm 3

buforem octanowym, miesza się i wstawia do łaźni wodnej o temperaturze 323 K. Po

10 minutach inkubacji w łaźni wodnej, kolejno do każdej probówki, w odstępach co 10

min, dodaje się po 1 cm 3 ekstraktu białek z drożdży ponownie miesza się i umieszcza

w łaźni wodnej. Stężenia sacharozy wynoszą kolejno: 0, 1, 2, 4, 10, 20, 60, 180 mM.

- [ ]

W takich samych odstępach czasu (co 10 min), po każdych 10 minutach dalszej

inkubacji, z kolejnych probówek pobiera się po 0.1 cm 3 roztworu, dodaje do 2.9 cm 3

odczynnika odbiałczającego, miesza, po 5 mim odwirowuje osad białka.

Do 1 cm 3 supernatantu dodaje się 1 cm 3 odczynnika miedziowego (zasadowy

roztwór winianu miedziowego), miesza, wstawia do wrzącej łaźni wodnej na 20 min. Po

ostudzeniu dodaje się 1 cm 3 odczynnika arseno-molibdenowego, wstrząsa do usunięcia

wydzielonego dwutlenku węgla, dodaje się 7 cm 3 wody, miesza i mierzy absorbancję

przy 660 nm. Stężenie cukrów redukujących odczytuje się z wcześniej przygotowanej

krzywej wzorcowej.

Przedstawiona poniżej na wykresie zależność stężenia produktów reakcji od

czasu początkowo układa się liniowo, czyli reakcja w początkowej części wykresu

zachodzi z prawie stałą szybkością. Po długim czasie szybkość reakcji zmniejsza się,

reakcja osiąga stan końcowy.

Wykres nachylenia krzywych początkowego przyrostu stężenia produktów

reakcji od czasu, czyli wykres szybkości początkowej reakcji od stężenia substratu,

przedstawia wycinek hiperboli.

Wraz ze wzrostem stężenia substratu, zwiększa się szybkość reakcji

i asymptotycznie zbliża się do wartości zwanej szybkością maksymalną Vm. Krzywą

zależności szybkości początkowej reakcji od stężenia sacharozy Menten opisała

równaniem zwanym równaniem Michaelis-Menten. Równanie to jest uproszczonym

rozwiązaniem równania reakcji równowagowej po której następuje reakcja

nieodwracalna:

E + S = ES

ES = E + P

gdzie: E - enzym, S - substrat, ES - kompleks enzym substrat, P - produkt.

Zakładając, że szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia

kompleksu ES, że szybkość maksymalna, czyli szybkość początkowa reakcji przy

nieskończenie wielkim stężeniu substratu, jest wprost proporcjonalna do całkowitego

stężenia enzymu, gdyż przy maksymalnie dużym stężeniu substratu, wystąpi

maksymalne przesunięcie równowagi reakcji w kierunku powstawania kompleksu ES.

W warunkach gdy mierzy się szybkość początkową reakcji można zaniedbać ubytek

stężenia substratu oraz przy znikomym stężeniu produktu reakcji można założyć, że

nie powstaje kompleks EP (enzym-produkt) w wyniku reakcji: E + P = EP.

Stała równowagi reakcji dysocjacji ES

[ ][ ]

[ ]

Przyjmując, że stężenie enzymu [E] w stanie równowagi jest równe stężeniu

całkowitemu enzymu [E(0)] pomniejszonemu o stężenie [ES], molowe stężenie

substratu jest tysiące razy większe od stężenia enzymu zatem powstawanie

kompleksu ES nie zmienia w istotnym stopniu stężenia substratu, równanie to

przyjmuje postać:

E S

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: