Peptydy i białka – prelekcja

     Peptydy są amidami aminokwasów, które powstają przez kondensację grupy karboksylowej jednego z aminokwasów i grupy aminowej drugiego. Nazywamy to kondensacją, ponieważ powstaje drobnocząsteczkowy produkt uboczny, jakim jest woda (gdyby nie to, zachodziłaby polimeryzacja). Peptydy dzielimy wg ilości aminokwasów, które wchodzą w jego składu, di- tri-, tetrapeptydy. Do 10 reszt aminokwasowych : oligopeptydy. 10-100 polipeptydy. Z alaniny i glicyny może powstać Ala-Gly, bądź Gly-Ala. Może powstać dipeptyd z dwóch cząsteczek alaniny, albo glicyny. Znamy 20 aminokwasów białkowych, dlatego ilość kombinacji jest praktycznie nieograniczona. Podaje się sekwencję           polipeptydu – z lewej storny jest aminokwas z wolną grupą aminową, z prawej strony z wolną grupą karboksylowa. Koniec z wolną grupą aminową to koniec n-terminalny, ten drugi          to c-terminalny. W takiej samej kolejności podaje się nazwę i sekwencję skrótami. Wiązanie peptydowe : ulega mezomerii (podobne zjawisko jak w pierścieniu benzenowym – elektrony pi są uwspólniane, tutaj elektrony pi mogą krążyć między węglem a azotem, mogąc tworzyć strukturę graniczną, cała ta struktura 3-węglowa jest płaska – co wynika z mezomerii).

Funkcje białek:

Hormonalna: oksytocyna i wazopresyna (peptydy składające się z 9 aminokwasów);

hormony tkankowe : angiotensyna, bradykinina, peptydy opioidowe, endorfiny, enkefaliny (peptydy o działaniu lokalnym, choć angiotensyna jest także związkiem o działaniu ogólnym, ma podwójne działanie)

Strukturalna: kolagen, elastyna, keratyna

Kurczliwość: aktyna, miozyna

Transportowa: hemoglobina, albuminy osocza, lipoproteiny

Receptorowa: białka błonowe

Odpornościowa: immunoglobuliny, interferon

Przemiany oksydoredukcyjne :  glutation (trójpeptyd, gammaglutamylocysteinyloglicyna, szczególna właściwość : kwas glutaminowy łączy się grupą gammakarboksylową)

Normalnie nie występują u człowieka, natomiast mają wpływ na niego : antybiotyki peptydowe : gramicydyna, kolistyna, bacytracyna. Toksyny węży, owadów.

Insulina i glukagon, ACTH – nie ma jednoznacznej odpowiedzi, czy to hormony peptydowe, czy białkowe, my skłaniamy się bardziej ku temu, iż są to hormony białkowe.

Najistotniejsza różnica między białkiem, a peptydem : białka mają swoją ściśle określoną konformację i tylko w tej konformacji działają prawidłowo.

Białka:

fibrylarne (alpha- i betakeratyna)

globularne

-          białka proste (nie zawierają nic poza łańcuchem peptydowym : albuminy, globuliny, histony, prolaminy, protaminy, gluteiny)

-          koniugowane (inaczej nazywane złożonymi, zawierają fragment niebiałkowy fosfoproteiny, chromoproteiny – zawierają barwnik, u człowieka najczęściej hemowy, glikoproteiny, glipoproteiny, nukleoproteiny, metaloproteiny)

Białka posiadają wysoce zróżnicowaną strukturę

-          I-rzędowa (sekwencja aminokwasów w całym łańcuchu peptydowym; mają ją zarówno polipeptydy, jak i białka; utrzymują ją wiązania peptydowe – kowalencyjne)

-          II-rzędowa (cały łańcuch polipeptydowy składa się z regularnych układów wiązań peptydowych, a reszty aminokwasowi są skierowane w bok – układ ten samoorganizuje się w strukturę alpha-helisy – stabilizacja przez wiązania wodorowe; strukturę beta-harmonijki przybiera mniejszość białek, spotyka się także pojęcie „struktura pofałdowanej kartki”; dla kolagenu charakterystyczna jest potrójna helisa, ponadto w kolagenie – odpowiada za to bardzo duża ilość proliny, hydroksyproliny i glicyny – są to aminokwasy, mają nieco odmienną budowę, niż pozostałe aminokwasy, z tego względu, że ma nieco inną budowę, między wiązaniami utrzymują się inne kąty; białko, które ma strukturę alpha-helisy może przekształcić się w beta-harmonijkę, co polega na zmianie układu wiązań wodorowych, komórka zauważając niedobór tworzy nowe białka o strukturze alpha-helisy, które jednak pod wpływem działania zmienionego w beta-harmonijkę białka same przybierają strukturę beta-harmonijki, dlatego też leczenie ludzi chorujących na choroby prionowe jest niemal niemożliwe; struktura beta-harmonijki ma dwa podtypy: przeciwrównoległy, taki, gdzie łańcuch aminokwasowy biegnie w jedną stronę, zakręca, a jego druga część zawraca w przeciwną stronę, drugim podtypem jest typ równoległy, kiedy dwa łańcuchy peptydowe stykają się blisko siebie; za budowę struktury II-rzędowej odpowiadają wiązania wodorowe między wiązaniami peptydowymi);

-          III-rzędowa (konformacja natywna, jeżeli zmienić trochę układ tej przestrzeni, białko praktycznie przestaje istnieć; jeżeli zniszczymy mostki dwusiarczkowe, a następnie utlenimy grupy tiolowe, by stworzyły nowe mostki dwusiarczkowi, to mimo, że te mostki powstaną, białko nie będzie już działać; struktura ta stabilizowana jest właśnie przez mostki siarczkowe, są to wiązania silne, kowalencyjne, drugi typ oddziaływań to oddziaływania hydrofobowe, tzw. „siły Van der Waalsa“, innym rodzajem oddziaływań są “mostki solne“ – jeżeli aminokwas ma dodatkową grupę aminową albo karboksylową, to w środowisku fizjologicznego pH organizmu aminokwasy zwykle są zdysocjowane i te różnoimienne ładunki mogą się przyciągać, ostatnim typem oddziaływań są wiązania wodorowe między resztami bocznymi)

-          IV-rzędowa (przestrzenne ułożenie łańcuchów, mają ją tylko niektóre białka, te, które składają się z więcej, niż jednego łańcucha peptydowego, te łańcuchy są osobno tworzone na rybosomach, a następnie składane, charakterystycznym białkem polimerycznym jest hemoglobina – tetrameryczne białko – tak samo jak dehydrogenaza mleczna)

Właściwości fizykochemiczne

-          charakter wielkocząsteczkowy (białka nie dializują w roztworach koloidalnych)

-          wywierają niskie ciśnienie osmotyczne

-          wędrówka w polu elektrycznym, uleganie elektroforezie

-          skręcają płszczyznę światła spolaryzowanego

-          mają zdolność wiązania jonów

-          pochłaniają światło

-          są wrażliwe na podwyższoną temperaturę i czynniki denaturujące (mocznik, stężone alkohole, kwasy, jony metali ciężkich, detergenty, garbniki)

-          ulegają hydrolizie (enzymatycznej przy udziale pepsyny, trypsyny, chymotrypsyny; kwaśnej – degradacji ulegają Trp, Ser, Thr; zasadowej – degradacji ulegają Arg, Cys, Thr)

     Do celów analitycznych często trzeba poddać białko hydrolizie, przy użyciu enzymów proteolitycznych, kwasów, zasad, ISTOTNE JEST, że hydroliza enzymatyczna jest najskuteczniejsza i najbardziej dokładna, ponieważ nie powoduje degradacji żadnych aminokwasów, w przeciwieństwie do np. kwasu solnego, czy środowiska zasadowego.

     Punkt izoelektryczny białek – pH, w którym białko ma średni ładunek równy zero. W takim punkcie nie porusza się w polu elektrycznym. W tym punkcie białko jest także najmniej rozpuszczalne, wykorzystuje się to do technik analitycznych, czy preparatywnych, wystarczy doprowadzić je do takiego punktu, a kiedy się wytrąci, odsączyć.

     Białka w fizjologicznym pH posiadają reszty boczne zdysocjowane, kwaśne i zasadowe. One mogą wiązać ze sobą jony soli. Do wsalania i wysalania białek stosuje się sole nie denaturujące, np. chlorek sodu, siarczan potasu, różne sole, które nie są solami metali ciężkich. Jeżeli do białko dodamy niewielkiej ilości takiej soli, rozpuszczalność jego rośnie. Do tych grup bocznych przyłączają się zdysocjowane kationy i aniony soli nieorganicznej, ciągnąc za sobą wodę, otoczkę hydratacyjną. Ta otoczka ułatwia rozpuszczanie białek. Rozpuszczalność dochodzi do maksimum, kiedy wysycane są wszystkie reszty boczne aminokwasów w białku. Od tej pory rozpuszczalność, przy dalszym dodawaniu soli zaczyna maleć, gdyż sól tworzy wtedy własną otoczkę hydratacyjną, zabierając wodę białku. Ten pierwszy etap nazywa się wsalaniem białka, drugi – wysalanie. Proces wysolenia białka jest odwracalny, gdyż dodając sól możemy wytrącić białko, odsączyć je, a sól oddializować i mamy białko rozpuszczone. Wysalanie jest odwracalne, denaturacja nie.

     Białka osocza i surowicy. W surowicy zdrowego człowieka jest od 6-8 g/dl białka, czyi 60-80 g/l. Musicie znać średnie wartości normy, nie trzeba znać zakresów (albuminy 60%, a1-globuliny 4% a2-globuliny 8% b-globuliny 12% g-globuliny 16%) Często wykonuje się rozdział elektroforetyczny i wybarwienie białka. Densytogram to wykres zależności natężenia barwy od drogi rozdziału. Nie musicie umieć rysować takiego densytogramu.       

     Ilościowe metody oznaczania białek (gdy będziecie opisywać metody, zwróćcie uwagę na taką kolejność : nazwa poprawna metody, krótko podstawa – co się stosuje, żadnych objętości itd., zakres metody (istotne), co zaburza daną analizę, czyli jakie składniki mogą zafałszować wynik i do czego się daną metodą stosuje w szczególności)

-          metody kolorymetryczne (metoda biuretowa, stosowana na ćwiczeniach, dodawano się jony miedzi; metoda Lowriego ze względu na dodatkowy odczynnik, którym jest kwas fosfomolibdenofosfowolframowy, inaczej zwany odczynnikiem Foemina zwiększa 1000 razy czułość, metodą tę stosuję się do oznaczania rozcieńczonych roztworów białek);

-          turbidymetria (istotna jest metoda Extona, stosowana do oznaczania białka w moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym)

-          spektrofotometria w UV

-          metoda Kiejdahla (przyjrzyjcie się jej uważnie, ponieważ jest to metoda referencyjna wobec innych metod, czyli dzięki niej kalibruje się inne metody; pierwszym etapem jest zwęglenie próbki białka przy udziale kwasu siarkowego, cały azot przechodzi wtedy w siarczan amonu, do tego zwęglonego białka dodaje się dużą ilość wodorotlenku sodu, by oddestylować ten amoniak – cały siarczan amonu rozkłada się pod wpływem wodorotlenku, odparowuje się amoniak i jest on zbierany w kolbie destylacyjnej w roztworze rozcieńczonego k. siarkowego, w tej kolbie tworzy siarczan amonu, ale to jest rozcieńczony kwas siarkowy o znanym stężeniu (istotne) – odmiareczkowujemy nadmiar tego kwasu wodorotlenkiem sodu o znanym stężeniu, wobec czego możemy oznaczyć ile było tego siarczanu amonu i wyliczyć wobec tego ile było białka; białka osocza zawierają 16% azotu, pozostałe od 12% do 30% dla histonów

-          metody immunologiczne (wcześniej omówione metody pozwalały oznaczać białko całkowite, czyli wszystkie białka w badanym płynie, metody immunologiczne pozwalają oznaczyć stężenie jednego, konkretnego białka, dlatego metody te są obecnie bardzo popularne, można nimi oznaczać również stężenia leków, antygeny, najczęściej stosuje się metodą Elisa)

-          sączenie molekularne

( metody te opisane są na kserach, zdjęciach, które mamy )

Dodatek J

     Wiązania wodorowe stabilizujące helisę powstają między grupą karbonylową jednego aminokwasu i grupą iminową aminokwasu umiejscowionego w łańcuchu o trzy jednostki aminokwasowe wcześniej: