Anna Michalska1, Eugenia Gospodarek1, Waldemar Placek2, Anna Chrzanowska3, Anika Doruchowska3
1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej w Bydgoszczy
Kierownik: dr hab. med. Eugenia Gospodarek, prof. nadzw. AM
2 Katedra i Klinika Dermatologii AM w Bydgoszczy
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. Waldemar Placek, prof. nadzw. AM
3 Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Akademii Medycznej w Bydgoszczy
Drobnoustroje izolowane od pacjentów z owrzodzeniami podudzi leczonych
w Klinice Dermatologii AM w Bydgoszczy w latach 2000-2002.
Słowa kluczowe: owrzodzenia podudzi, zakażenia bakteryjne, oporność na antybiotyki.
Microorganisms isolated from patients with legs ulcerations treated in the Department of Clinical Dermatology, Medical University in Bydgoszcz, in years 2000-2002.
Key words: legs ulcerations, bacterial infections, antibiotic resistance.
Wstęp. Celem badań była ocena występowania i lekowrażliwości drobnoustrojów izolowanych od pacjentów z owrzodzeniami podudzi hospitalizowanych w Klinice Dermatologii Samodzielnego SPSK AM w Bydgoszczy w latach 2000-2002.
Materiały i metody. Analizą objęto 552 materiały ropne: 503 (91,1%) wymazy z owrzodzeń, 38 (6,9%) wymazów z ran i 11 (2,0%) prób ropy pobrane od pacjentów hospitalizowanych. Identyfikację przeprowadzano na podstawie morfologii kolonii i cech biochemicznych w testach API i ID (bioMérieux). Ocenę antybiotykowrażliwości drobnoustrojów przeprowadzono metodą krążkowo-dyfuzyjną, zachowując wymagane warunki standaryzacji podane przez NCCLS.
Wyniki. Wykazano obecność 1192 drobnoustrojów w 529 (95,8%) próbach. Bakterie Gram-dodatnie które stanowiły 51,4% wyhodowanych drobnoustrojów. Najczęściej izolowano gronkowce - 24,9%, enterokoki - 10,1%, paciorkowce - 9,2%, maczugowce - 5,5%. Grzyby z rodzaju Candida stanowiły 1,3%. Wśród 48,6% szczepów bakterii Gram-ujemnych dominowały pałeczki P. aeruginosa - 17,9%, P. mirabilis - 8,7%, E. coli - 4,8%, Pseudomonas sp. - 3,8%. Wszystkie enterokoki były wrażliwe na glikopeptydy. Prawie 79% gronkowców S. aureus i CNS wytwarzało penicylinazę, a 14,4% szczepów S. aureus i 37,5% szczepów CNS było metycylinoopornych. W ciągu trzech lat stwierdzono ogółem 2 szczepy ESbLs : P. mirabilis i E. coli. Indukowane b-laktamazy Amp C wykazano u 148 szczepów. Wśród nich były: P. aeruginosa, Pseudomonas sp. M. morganii oraz P. mirabilis, C. freundii, E. coli, E. cloaceae, A.. hydrophilia, S. marcescens.
Wnioski.
1. W owrzodzeniach podudzi stwierdzono większą częstość występowania zakażeń wywołanych S. aureus, Staphylococcus sp., P. aeruginosa, Enterococcus sp. i pałeczekami Enterobacteriaceae.
2. Przedstawiona w pracy ocena lekowrażliwości wyosobnionych szczepów daje lekarzom możliwość wykorzystania i zastosowania uzyskanych wyników antybiotykowrażliwości w leczeniu empirycznym owrzodzeń żylakowatych podudzi.
Summary
Introduction. The purpose of our study was to evaluate the occurrence and the susceptibility to antibiotics of microorganisms isolated from patients with legs ulcerations hospitalized in the Department of Clinical Dermatology of State Clinical Hospital, Medical University in Bydgoszcz during the years 2000-2002.
Materials and methods. The material analysed consisted of the 552 purulent diagnostic samples: 503 (91,1%) ulcerations swabs, 38 (6,9%) wound swabs and 11( 2,0%) pus samples from hospitalized patients. The species were identified by morphological characteristics and by using Api and ID tests (bioMérieux). The susceptibility to antibiotics was determined by disk-difffusion method in accordance to NCCLS quidelines.
Results. It was demonstrated the presence of 1192 microorganisms in 529 (95,8%) samples. Among them 51,4% were constituted by Gram-positive bacteria. The most frequently were isolated staphylococci - 24,9%, enterococci - 10,1%, streptococci - 9,2%, coryneform - 5,5%. The fungis of Candida sp. were isolated in 1,3%. Among 48, 6% Gram-negative bacteria there dominated rods were: Pseudomonas aeruginosa - 17,9%, Proteus mirabilis - 8,7%, Escherichia coli - 4,8%, Pseudomonas sp. - 3,8%. All the Enterococcus strains were susceptible to glicopeptides. 79% strains of stapylococci were found to produce penicylinase. 14,4% S. aureus and 37,5% CNS were resistance to methicillin. Only 2 strains of P. mirabilis and E. coli ESbLs-producing were isolated during the period of three years. In 148 cases the presence of inducible b-laktamases Amp C - producing strains were detected. Among strains were: P. aeruginosa, Pseudomonas sp., M. morganii, P. mirabilis, C. freundii, E. coli, E. cloaceae, A.. hydrophilia and S. marcescens.
Conclusions.
1. The most frequently observed bacteria isolated from patients with legs ulcerations were: S. aureus, Staphylococcus sp., P. aeruginosa, Enterocooosus sp. and Enterobacteriaceae.
2. The results of the susceptibility to antibiotics of strains isolated in our study point to the possibility of the usage of these results in an empirial treatment of patients with legs ulcerations.
Wstęp
W każdym społeczeństwie owrzodzenia podudzi stanowią ważny problem ekonomiczny i socjalny. Przy wydłużającym się średnim wieku życia populacji koszty leczenia chorych z owrzodzeniami są zawsze wysokie ze względu na przewlekłość choroby oraz różnorodność środków terapeutycznych stosowanych podczas choroby i w okresie remisji (1).
Owrzodzeniem goleni nazywamy przewlekły ubytek masy skórno-mięśniowej zlokalizowany najczęściej w okolicy jednej trzeciej dolnej części goleni, ustępujący z pozostawieniem blizny. U podłoża owrzodzeń leżą między innymi choroby naczyń (pochodzenia żylnego, tętniczego, limfatycznych i inne), neuropatie, choroby metaboliczne (cukrzyca, miażdżyca), zaburzenia hematologiczne, białkowe, urazy, oparzenia, odmrożenia, choroby nowotworowe i mieszane zakażenia bakteryjne (1, 2, 3).
Badania przeprowadzone w Niemczech, Anglii, Szwajcarii, Norwegii, Szwecji, Danii i Francji wykazały, że częstość występowania owrzodzeń wynosi około 1-3,5% na 1000 osób, z przewagą kobiet (2,8:1) i w przedziale wiekowym 65-80 lat stanowi już 6% (1,3). W około 55% przypadków owrzodzeń leczenie trwa około 3 miesiące, a w 78% owrzodzeń nawet 6-9 miesięcy i możliwy jest nawrót choroby (4).
Do najpoważniejszych i najcięższych powikłań owrzodzeń kończyn należą zakażenia bakteryjne, którym sprzyjają miejscowe procesy zapalne, zaburzenia troficzne, osłabienie funkcji obronnej skóry i niewydolność krążenia żylnego w obrębie kończyn doprowadzająca do niedokrwienia tkanek. O wystąpieniu objawów zakażenia decyduje liczba drobnoustrojów w ranie. Dane literaturowe (5) podają, że zakażenia bakteryjne rozwijają się, gdy liczba drobnoustrojów w ranie przekracza 105/ cm2 lub gram tkanki. W przypadku niedokrwienia do wystąpienia objawów zakażenia wystarczająca jest już liczba 5x104/ cm2 (6, 7). Na ciężkość i przebieg zakażenia oprócz liczby drobnoustrojów zakażających mają wpływ też rodzaj flory bakteryjnej powodującej zakażenie i jej lekowrażliwość na stosowane antybiotyki i chemioterapeutyki.
W związku z trudnościami w leczeniu ran i owrzodzeń jakie niosą za sobą zakażenia celem niniejszej pracy była ocena występowania i lekowrażliwości drobnoustrojów izolowanych od pacjentów z owrzodzeniami podudzi leczonych w Klinice Dermatologii Samodzielnego Publicznego Szpitala Klinicznego Akademii Medycznej (SPSK AM) w Bydgoszczy w latach 2000-2002.
Materiał i metody
Analizą objęto 552 materiały ropne pobrane od pacjentów leczonych w Katedrze i Klinice Dermatologii Samodzielnego Szpitala Klinicznego Akademii Medycznej (SPSK AM) w Bydgoszczy w latach 2000-2002. Wśród badanych materiałów były 503 (91,1%) wymazy z owrzodzeń, 38 (6,9%) wymazów z ran i 11 (2,0%) prób ropy. Z materiałów wykonywano posiew na agar czekoladowy, Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej, MacConkey Agar (Becton Dickinson), Pyocyanosel Agar, D-Coccosel Agar, Sabouraud Agar oraz na bulion mózgowo-sercowy (bioMérieux). Hodowle inkubowano w temperaturze 370C przez 18-24 godzin w atmosferze tlenowej, a posiewy na podłożu czekoladowym w atmosferze 5% CO2.
Wyosobnione drobnoustroje identyfikowano na podstawie morfologii kolonii i cech biochemicznych wykonując między innymi testy API i ID (bioMérieux). Odczyty testów prowadzono w systemie komputerowym ATB Expression z bazą danych wersja V 2. 8. 8. (bioMérieux).
Ocenę antybiotykowrażliwości drobnoustrojów przeprowadzono metodą krążkowo-dyfuzyjną według Kirby-Bauera, zachowując wymagane warunki standaryzacji podane przez NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (8). Do badania użyto zawiesinę bakteryjną o zmętnieniu 0,50 według skali MacFarlanda i podłoże Mueller-Hinton II Agar (Becton Dickinson). Krążki z antybiotykami (Becton Dickinson) dobierano zgodnie z zaleceniami Krajowego Ośrodka ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów w Warszawie (9).
Do oznaczania wrażliwości enterokoków na wysokie stężenia aminoglikozydów (high level aminoglicosydes resistance, HLAR) stosowano podłoże Brain-Heart Infusion Agar (BHI) (bioMérieux) z gentamycyną 500 mg/l oraz ze streptomycyną 2000 mg/l.
Metycylinooporność (methicillin resistance, MR) u gronkowców oznaczano stosując krążki z oksacyliną (1mg/ml) (bioMérieux). Płytki antybiogramowe inkubowano 18-24 godzin w atmosferze tlenowej w temperaturze 350C. Wyniki interpretowano w oparciu o aktualne tabele NCCLS (8).
W celu wykrycia enzymów o rozszerzonym zakresie działania (extended spectrum b-lactamases, ESbLs) wykonano test dwóch krążków według metody Jarliera i wsp. (10). Stosowano krążki z czterema antybiotykami: ceftazydym (30 ųg/ml), cefotaksym (30 ųg/ml) i aztreonam (30 ųg/ml) oraz krążek z amoksycyliną i kwasem klawulanowym (20+10 ųg/ml). Odległość między środkami krążków wynosiła 2 cm. Powstanie lub powiększenie strefy zahamowania wzrostu bakterii od strony krążka z inhibitorem po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 35oC interpretowano jako wynik świadczący o ekspresji ESbLs.
Obecność indukowanych b-laktamaz (inducible b-lactamases, IbLs) wykrywano według metody dwóch krążków Sanders i Sanders (11). Zastosowano dwa antybiotyki jako substraty IbLs – ceftazydym (30 ųg/ml) i ceftriakson (30 ųg/ml) oraz induktor - cefoksytynę (30 ųg/ml) (bioMérieux). Odległość między brzegami krążków z substratami, a krążkiem z induktorem wynosiła 8 mm. Płytki inkubowano w takich samych warunkach jak w przypadku wykrywania ESbLs. Zmniejszenie strefy zahamowania wzrostu szczepu wokół krążków z ceftazydymem i ceftriaksonem od strony krążka z induktorem świadczyły o wytwarzaniu IbLs.
Wyniki
Analiza mikrobiologiczna 552 materiałów ropnych wykazała obecność 1192 drobnoustrojów w 529 (95,8%) próbach. Wśród posiewów dodatnich były 483 (91,3%) wymazy z owrzodzeń, 36 (6,8%) wymazów z ran oraz 10 (1,9%) prób ropy. Z wymazów z owrzodzeń izolowano 1109 (93,0%) szczepów, z ran 51 (4,9%), a z ropy 14 (2,0%) szczepów. Drobnoustroje najczęściej izolowane z wszystkich materiałów ropnych w analizowanym okresie przedstawia tab. I.
Szczególną ocenę występowania i lekowrażliwości drobnoustrojów przeprowadzono dla szczepów izolowanych z wymazów z owrzodzeń, ponieważ stanowiły one ponad 90% wszystkich pobranych materiałów ropnych. Wykazano obecność 1109 drobnoustrojów w 483 dodatnich posiewach. Najczęściej izolowane szczepy przedstawia ryc. 1.
Wyosobniono 570 szczepów bakterii Gram-dodatnich, które stanowiły 51,4% wyhodowanych drobnoustrojów. Najczęściej izolowano gronkowce (24,9%), enterokoki (10,1%), paciorkowce (9,2%), maczugowce (5,5%). Grzyby z rodzaju Candida stanowiły 1,3%.
Wśród 276 szczepów gronkowców odpowiedzialnych za zakażenia 172 (62,3%) stanowiły szczepy Staphylococcus aureus, a 104 (37,7%) określone jako Staphylococcus sp. należały do gronkowców koagulazo-ujemnych (coagulase-negative staphylococci, CNS) (S. epidermidis, S. haemolyticus, S. capitis, S. warnerii, S. simulans). Wszystkie szczepy gronkowców wykazywały wrażliwość na glikopeptydy. Wysoką wrażliwość szczepów S. aureus zaobserwowano też wobec kwasu fusydowego (97,4%), ryfampicyny (95,3%), kotrymoksazolu (93,4%), cyprofloksacyny (91,6%), mupirocyny (91,4%). Wrażliwość na pozostałe antybiotyki przedstawia ryc. 2. Prawie 79% gronkowców S. aureus i CNS wytwarzało penicylinazę, a 14,4% szczepów S. aureus i 37,5% szczepów CNS było MR.
Enterokoki (E. faecalis - 95 (86,4%), E. faecium - 3 (2,7%) i Enterococcus sp. - 12 (10,9%) szczepów) uczestniczyły w 110 przypadkach infekcji z owrzodzeniami. Wszystkie szczepy były wrażliwe na glikopeptydy i imipenem. E. faecalis wykazywały również wysoką wrażliwość na ampicylinę (97,3%), oraz średnią na ciprofloksacynę (55,5%) i gentamycynę (44,4%). Oporność na wysokie stężenie gentamycyny wykazywało 29,6%, a na streptomycyny 49,7% szczepów.
Wśród 539 (48,6%) szczepów bakterii Gram-ujemnych wyosobnionych z owrzodzeń dominowały pałeczki Pseudomonas aeruginosa - 199 (17,9%), Proteus mirabilis - 97 (8,7%), Escherichia coli - 53 (4,8%), Pseudomonas sp. - 42 (3,8%) szczepów.
Wśród pałeczek P. aeruginosa odsetek szczepów wrażliwych na imipenem wynosił w 2000 roku - 100,0%, w 2001 - 85,9%, a w 2002 - 97,9% (średnio 94,6%). Bardzo dobrą aktywność wobec tych pałeczek wykazywała kolistyna (97,4%), piperacylina/tazobactam (89,0%), ceftazydym (88,5%). Ponad 84% szczepów było wrażliwych na aztreonam, a 82,4% na amikacynę. Wyniki wrażliwości na pozostałe antybiotyki przedstawia ryc. 3.
Wszystkie pałeczki E. coli były wrażliwe na meropenem i imipenem, natomiast wrażliwość pałeczek P. mirabilis na te antybiotyki wynosiła średnio 98,9% (ryc. 4). Wrażliwość na cefalosporyny II i III generacji wyżej wymienionych szczepów wynosiła odpowiednio: na cefuroksym - 73,9% dla P. mirabilis, 81,2% dla E. coli, na ceftazydym - odpowiednio 98,9% i 93,7%, a na cefotaksym - 97,3% i 93,7%. Wysoką aktywnością wobec pałeczek Enterobacteriaceae charakteryzowały się także fluorochinolony, a wśród nich ciprofloksacyna, która była aktywna w 99,3% wobec P. mirabilis i w 100,0% wobec E. coli.
W ciągu trzech lat monitorowania lekowrażliwości ESbLs stwierdzono ogółem u dwóch szczepów: P. mirabilis - w 2000 r. i E. coli w 2001 r. izolowanych od pacjentów z owrzodzeniami podudzi. Florę towarzyszącą w obydwu przypadkach stanowiły enterokoki.
Indukowane b-laktamazy Amp C wykazano u 148 szczepów. Najczęściej występowały u szczepów P. aeruginosa (67,3% wszystkich IbLs), Pseudomonas sp. (8,9%), M. morganii (6,7%), oraz pojedynczo u P. mirabilis, C. freundii, E. coli, E. cloaceae, A. hydrophilia, S. marcescens.
Dyskusja
Jednym z groźnych powikłań w leczeniu owrzodzeń u pacjentów oddziałów dermatologicznych są zakażenia bakteryjne. Niestety niewiele jest informacji na temat drobnoustrojów izolowanych od takich pacjentów. Dostępne dane literaturowe (4, 5) podają , że drobnoustrojami dość często izolowanymi w takich przypadkach są: S. aureus (w tym szczepy MRSA), Staphylococcus sp. CNS, P. aeruginosa, E. coli, E. faecalis, Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Acinetobacter sp. W wielu zakażeniach coraz częściej stwierdza się także bakterie beztlenowe między innymi Propionibacterium acnes i Peptostreptococcus sp., jako czynniki etiologiczne w zakażeniach owrzodzeń występujących w miażdżycowej niedrożności tętnic (1). W hodowlach z wymazów z owrzodzeń podudzi stwierdza się również różne gatunki grzybów drożdżopodobnych, które mogą stanowić wtórne zakażenia przeniesione prawdopodobnie z przestrzeni międzypalcowych stóp (2).
Jak wykazały przedstawione badania wśród drobnoustrojów wyosobnionych przez nas z wymazów z owrzodzeń podudzi także dominowały szczepy S. aureus, Staphylococcus sp. CNS, Enterococcus sp. (wśród Gram-dodatnich drobnoustrojów) i pałeczki P. aeruginosa oraz Enterobacteriaceae (wśród bakterii Gram-ujemnych). Odnotowano również 1,3% udział grzybów Candida sp. w zakażeniach pacjentów z oddziału dermatologicznego.
W każdym przypadku owrzodzenia istnieje prawdopodobieństwo kolonizacji owrzodzeń endogenną florą bakteryjną ze skóry pacjenta. W związku z tym ważna jest ocena kliniczna dokonana przy współpracy mikrobiologa i lekarza klinicysty oraz podjęcie decyzji na temat podawania leków przeciwbakteryjnych.
...
Endress