Wyjaławianie.docx

Wyjaławianie

Jest jednostkowym procesem technologicznym polegającym na zabiciu lub usunięciu ze środowiska lub materiału wszystkich drobnoustrojów w ich formach wegetatywnych i przetrwalnikowych. Można to osiągnąć działaniem czynników fizycznych lub chemicznych. Wyjaławianiu poddaje się ciała stałe, płynne lub gazowe. Zależnie od rodzaju i właściwości materiałów lub preparatów i sposobu ich produkcji stosuje się różne metody wyjaławiania. Wymagają one odpowiedniej aparatury, która ma zapewnić okreslone parametry procesu wyjaławiania.

Najczęściej stosowanymi metodami są:

Ø      Wyżarzanie i spalanie

Ø      Wyjaławianie suchym gorącym powietrzem

Ø      Wyjaławianie nasyconą parą wodną pod ciśnieniem

Ø      Wyjaławianie przez sączenie

Ø      Wyjaławianie za pomocą promieniowania (jonizującego, nadfioletowego)

Ø      Wyjaławianie za pomocą gazów (tlenek etylenu, formaldehyd)

Ø      Wyjałąwianie za pomocą roztworów środków chemicznych (aldehyd glutarowy, kwas nadoctowy)

Wyżarzanie i spalanie

Wyjaławianie przez wyżarzanie w płomieniu palnika powoduje spalenie komórek drobnoustrojów. Zabieg ten może być stosowany tylko w odniesieniu do drobnych przedmiotów metalowych, np. ezy – przy posiewach mikrobiologicznych.

Wyjaławianie przez spalanie stosuje się głównie do przedmiotów mało wartościowych.

Wyjaławianie suchym gorącym powietrzem

Działanie suchego gorącego powietrza w wyniku utleniania prowadzi do nieodwracalnej inaktywacji i degradacji składników komórkoweych drobnoustrojów (kwasy nukleinowe, białka) powodując w rezultacie ich zabicie.

Wyjaławianie suchym gorącym powietrzem prowadzi się w zamkniętych komorach, tzw. sterylizatorach powietrznych z termoregulacją, zapewniających krążenie gorącego powietrza. Warunkiem prawidłowego przebiegu procesu jest odpowiednio wysoka temperatura i czas wyjaławiania. FP VI poleca następujące parametry wyjaławiania suchym gorącym powietrzem:

Wybrane parametry wyjaławiania są uzależnione od rodzaju i właściwości materiałów. Metoda ta znajduje zastosowanie do wyjaławiania przedmiotów szklanych, ceramicznych i metalowych. Suchym gorącym powietrzem można również wyjaławiać niektóre substancje nie wrażliwe na wysoką temperaturę i nie zawierające wody np. chlorek sodu oraz związki mineralne np. talk, tlenek cynku, a także oleje roślinne, glikole, wazelina, parafina. Można również wyjaławiać roztwory olejowe pod warunkiem, że substancja lecznicza zawarta w roztworze nie ulegnie w tych warunkach rozkładowi.

Tą metodą nie należy wyjaławiać przedmiotów wykonanych z gumy, tworzyw sztucznych, a także materiałów opatrunkowych, bibuły.

Materiały wyjaławiane tą metodą powinny być czyste i suche. Należy je odpowiednio zabezpieczyć, aby po skończonym procesie wyjaławiania i wyjęcia ich ze sterylizatora powietrznego, a także w czasie przechowywania nie uległy wtórnemu skażeniu. Stosuje się do tego celu najczęściej termoodporne folie z tworzywa sztucznego w kształcie toreb różnej wielkości lub rękawów.

Suche gorące powietrze przenika bardzo wolno w głąb wyjaławianych materiałów i dlatego cykl tego procesu jest stosunkowo długi, z tego też powodu czas wyjaławiania nie należy liczyć od momentu włożenia materiału do sterylizatora powietrznego, ale od chwili gdy materiał osiągnie wymaganą temperaturę, w której będzie przebiegał proces wyjaławiania.

Podczas wyjaławiania suchym gorącym powietrzem materiał powinien być włożony w sterylizatorze powietrznym w taki sposób, aby nie utrudniał swobodnego krążenia gorącego powietrza.

Suche gorące powietrze jest również wykorzystywane do depirogenizacji np. przedmiotów szklanych. W tym celu przetrzymuje się je w temp. 2000C przez 60 min. lub w temp. 2500C przez 30 min. W tych samych warunkach można zdepirogenizować np. chlorek sodu.

Wyjaławianie nasyconą parą wodną pod ciśnieniem

Nasycona para wodna w wyniku hydrolizy powoduje denaturację i koagulację enzymów, a także innych ważnych dla życia struktur komórkowych, powodując w konsekwencji zabicia drobnoustrojów. Wyjaławianie odbywa się w temp. 108 – 1340C przez 15 – 30 min. Wyjaławianie nasyconą parą wodną pod ciśnieniem jest najskuteczniejszą metodą wyjaławiania. Do tego celu służą hermetycznie zamykane o specjalnej konstrukcji aparaty ciśnieniowe – autoklawy, wyposażone w podstawowe urządzenia pomiarowe – termometr, manometr, a także zawór zabezpieczający.

Schemat budowy autoklawu:

1.      Ogrzewanie

2.      Woda

3.      Wkładka perforowana

4.      Odpowietrzanie

5.      Para

Zasada, na której opiera się działanie autoklawu polega na tym, że woda wrze w temp. 1000C wówczas gdy ciśnienie pary jest równe ciśnieniu otaczajacej atmosfery. Jeżeli ciśnienie w hermetycznie zamkniętym zbiorniku zwiększa się, wzrasta również temp. wrzenia wody powyzej 1000C. ogrzewana woda powoduje, że powstajaca w tych warunkach para wodna pochłania i magazynuje ciepło w postaci utajonej, aż do czasu wytworzenia się stanu równowagi. Po wytworzeniu stanu równowagi para wodna będąca w stanie nasyconym ma tę samą temperaturę co wrząca woda, z której została wytworzona. Ciepło pochłonięte nazywa się ciepłem utajonym pary. Gdy para wodna styka się z chłodniejszym od niej przedmiotem oddaje mu swoje ciepło utajone i skrapla się – spadek ciśnienia powoduje wówczas dalszy dopływ pary aż do momentu, gdy temperatura w miejscu styku z wyjaławianym materiałem będzie równa temperaturze pary.

W czasie wyjaławiania w autoklawie nasyconą parą wodną obserwuje się cztery okresy pary:

1.      Czas nagrzewania – jest niezbędny do przeniknięcia ciepła w głąb każdego materiału przeznaczonego do wyjałowienia. W przypadku wyjaławiania roztworów przenikliwość ta zależy od przewodnictwa ciepła przez ściany pojemników, a także od ich wielkości i stopnia wypełnienia roztworem. Ponieważ czas nagrzewania jest inny dla różnych pojemników dlatego nie należy je wyjaławiać współnie lecz oddzielnie.

2.      Wyrównywanie temperatury – jest tym dłuższy im większa jest objętość wyjaławianych płynów w pojemniku.

3.      Czas wyjaławiania – zabicie wszystkich drobnoustrojów wymaga utrzymywania temperatury na ustalonym poziomie przez dostatecznie długi okres.

4.      Czas schładzania – jest to czas od chwili przerwania dopływu energii cieplnej do momentu gdy manometr wskarze wewnątrz komory ciśnienie równe atmosferycznemu.

Niezbędnym warunkiem skuteczności wyjaławiania nasyconą parą wodną jest konieczność usunięcia powietrza z komory sterylizacyjnej autoklawu przed rozpoczęciem właściwego procesu. Mieszanina pary i powietrza ma znacznie słabsze działanie wyjaławiające niż sama para wodna. Powietrze z komory wyjaławiającej autoklawu można usunąć stosując próżnię lub na zasadzie grawitacyjnej wymiany powietrza przez parę. Po usunięciu powietrza z wnętrza komory wyjaławiającej i zamknięciu zaworu odpowietrzajacego wzrasta temperatura i zwiększa się ciśnienie pary wodnej w autoklawie. Gdy temperatura i ciśnienie pary osiagną wymagany poziom wówczas rozpoczyna się cykl właściwegowyjaławiania.

Polecane przez FP VI warunki wyjaławiania to:

ü      Temperatura 1210C

ü      Ciśnienie 101,4 kPa

ü      W czasie nie krótszym niż 12 min

Przy nadciśnieniu powyżej 101,4 kPa i temperaturze 1280C lub 1340C stosuje się odpowiednio krótszy czas wyjaławiania. Czas wyjaławiania powinien być liczony od chwili całkowitego usunięcia powietrza z wnętrza autoklawu i osiągnięcia przez wyjaławianie materiały wymaganej dla danego procesu temperatury. Przy wyjaławianiu dużych pojemników czas wyjaławiania należy przedłużyć.

Wyjaławianie płynów:

Podczas ogrzewania wewnątrz hermetycznie zamkniętych pojemników z roztworami wytwarza się nadciśnienie, którego wielkość zależy od stopnia wypełnienia. Jeżeli pojemnik jest wypełniony powyżej 90% objętości to ciśnienie w jego wnętrzu jest tak duże, że istnieje niebezpieczeństwo jego rozerwania. Dlatego też doświadczalnie ustalono, że płyn nie powinien zajmować więcej niż 85% objętości pojemnika. Nasycona para wodna wypełniająca komorą sterylizacyjną autoklawu w zetknięciu z pojemnikami wypełnionymi roztworem oddaje swoje ciepło utajone ogrzewając pojemnik i jego zawartość do chwili aż temperatura roztworu zrówna się z temperaturą pary. Ogrzewany roztwór w hermetycznie zamkniętym pojemniku paruje powodując powstanie pary nasyconej nad wyjaławianym roztworem, obie fazy (roztwór i para wodna) pozostają w równowadze w określonych warunkach ciśnienia i temperatury. Wytworzona nad roztworem w hermetycznie zamkniętym pojemniku nasycona para wodna ma działanie wyjaławiające i to ona powoduje zabicie drobnoustrojów. Z tego powodu nie należy w autoklawie wyjaławiać pustych hermetycznie zamkniętych opakowań np. butelek, ponieważ w pustym pojemniku nie ma się z czego wytworzyć nasycona para wodna.

W autoklawie nie powinno się wyjaławiać olejów, roztworów olejowych i innych płynów, które nie są układami wodnymi.

Wyjaławianie roztworów,  które nie są w pojemnikach szklanych lecz w pojemnikach z tworzyw sztucznych, wymaga innego postępowania. Dotyczy to np. płynów infuzyjnych w pojemnikach w kształcie butelek lub worków z tworzywa sztucznego. Są one elastyczne, a ciśnienie, które w nich powstaje podczas wyjaławiania mogłoby spowodować nie tylko ich trwałe zniekształcenie lecz także rozerwanie. Z tych powodów w czsie wyjaławiania konieczne jest stałe utrzymywanie większego ciśnienia niż to jakie zapewnia ciśnienie nasyconej pary wodnej. Wykorzystuje się do tego celu powietrze. Zakres tego ciśnienia zależy od typu i rodzaju pojemników, a także wielkość warstwy powietrznej nad roztworem w zamkniętym pojemniku. W tym przypadku usuwanie powietrza z komory autoklawu przed rozpoczęciem właściwego cyklu wyjaławiania nie jest konieczne. Zadaniem wprowadzonej do komory pary jest m.in. utrzymywanie wymaganej temperatury, a ciśnienie kontrolowane jest wprowadzaniem do komory sprężonego filtrowanego powietrza. Innym rozwiazaniem wykorzystywanym do wyjaławiania płynów w pojemnikach z tworzyw sztucznych jest stosowanie przegrzanej wody. W tym celu ogrzewana woda, która krąży w systemie ciepłym jest wtryskiwana do komory wyjaławiającej autoklawu. Ciśnienie w komorze kontrolowane jest wprowadzeniem filtrowanego sprężonego powietrza.

Wyjaławianie odzieży ochronnej, opatrunków, narzędzi

Najbardziej użyteczne w tym przypadku sa autoklawy o podwójnych ścianach tzw. płaszczowe. Wyjaławiane materiały poddaje się przez 15 – 30 min. (zależy od rodzaju wyjaławianego materiału, wielkości pakietów) działaniu temperatury 132 – 1340C, co odpowiada nadciśnieniu 202,6 kPa.

Wyjaławianie materiałów włónkistych wymaga bardzo dokładnego usunięcia powietrza z całej objętości porowatego materiału. W tym celu wyjaławiany materiał powinien być luźno ułożony, aby nie utrudniał odpowietrzania i swobodnego dostępu pary wodnej. Jest to niezbędne ponieważ tylko wtedy materiały włókniste stają się przepuszczalne dla pary, której bezpośrednie działanie warunkuje zabicie wszystkich drobnoustrojów, w przeciwnym razie tworzą się duże obszary zalegającego powietrza utrudniające wyjałowienie znacznych partii materiału. Proces wyjaławiania kończy się wytworzeniem podciśnienia, które zapewnia całkowite wysuszenie wyjaławianych materiałów.

Materiały przeznaczone do wyjaławiania powinny być odpowiednio zabezpieczone, aby po wyjęciu z autoklawu nie uległy wtórnemu skażeniu. Do tego celu można użyć folii, papieru, a także puszek Schimmelbuscha.

Do wyjaławiania drobnych narzędzi chirurgicznych i utensyliów polecane są małe przenośne autoklawy, w których potrzebna do wyjałowienia para wodna powstaje w komorze wyjaławiającej autoklawu w wyniku wrzenia wody. Pojedynczy cykl wyjaławiania przebiega zwykle w temperaturze 134 – 1380C. w tego typu autoklawach poleca się wyjaławiać narzędzia chirurgiczne i inne drobne przedmioty bez opakowania. Wyjałowione w ten sposób narzedzia nie mogą być przechowywane, ale po otwarciu pokrywy autoklawu sa przeznaczone do natychmiastowego użycia.

Wyjaławianie przez sączenie

Metoda ta polega na usuwaniu drobnoustrojów z roztworów, a także gazów za pomocą sączków o średnicy porów 0, 2 µm i mniejszej. Warunki te spełniają sączki membranowe.

Sączki membranowe są cienkimi błonami o grubości 70 – 140 µm. mają kształt krążków o różnej średnicy lub arkuszy. Arkusze mają duże powierzchnię sączenia i w postaci pofałdowanej zamknięte są w kapsułkach.

Sączki membranowe mają wiele zalet:

o       Nie zmieniają pH sączonego roztworu

o       Nie adsorbują substancji z sączonego roztworu, a wyjaławiane tą metodą roztwory nie wypłukują żadnych niepożądanych substancji z przegrody sączącej.

Sączki membranowe można wyjaławiać w autoklawie tlenkiem etylenu, a wykonane z politetrafluoroetylenu nawet suchym gorącym powietrzem.

Współcześnie wyprodukowane sączki w kształcie krążków są przeznaczone do jednorazowego użytku, natomiast inne (umieszczone w kapsułkach) są przeznaczone do wielokrotnego stosowania.

Wyjaławianie płynów:

Ma zastosowanie przede wszystkim do wyjaławiania roztworów substancji leczniczych wrażliwych na temperaturę np. roztworów witamin, a także preparatów biologicznie czynnych np. surowice, niektóre szczepionki, enzymy.

Sączenie roztworów przez sączki membranowe odbywa się w specjalnie przygotowanych do tego celu zestawach dostosowanych do pracy zarówno przy nadciśnieniu jak i podciśnieniu. Umożliwiają one sączenie zarówno małych cząstek roztworu jak i bardzo dużych.

Do sączenia wyjaławiających bardzo duże cząstki roztworów np. w przemyśle farmaceutycznym zastosowanie mają urządzenia wieloczęściowe.

Do sączenia małych roztworów używa się strzykawek z tworzywa sztucznego, wewnątrz, których jest umieszczony sączek membranowy.

Zasada wyjaławiania płynów przez sączenie polega na usunięciu drobnoustrojów ze sączonego roztworu przez zatrzymanie ich na sączku. W tym celu należy użyć jałowego zestawu sączącego wraz z sączkiem membranowym i jałowym odbieralnikiem po przesączeniu roztwór w warunkach aseptycznych rozlewa się do jałowych pojemników i natychmiast zamyka.

Wyjaławianie powietrza:

Małe objętości powietrza np. wprowadzane do komory autoklawu jak również gazy stosowane w lecznictwie. Wyjaławia się za pomocą hydrofobowych sączków membranowych. Natomiast duże objętości powietrza np. w przypadku produkcyjnej przestrzeni pracy gdzie muszą być spełnione rygory z aseptyki. Wyjaławia się za pomocą filtrów HEPA. Są to konstrukcje o grubości ok. 30 µm. wykonane z włókien szklanych o średnicy 0, 1 µm połączonych żywicą lub inną substancją wiążącą np. akrylową. Zwykle są pofałdowane i wielowarstwowe i w ten sposób zapewniają maksimum powierzchni filtracyjnej. Filtr HEPA zatrzymuje 99, 9997% cząsteczek o średnicy 0, 3 µm i są najskuteczniejsze przy szybkości powietrza 0, 3m/sek.

Zasada ich działania opiera się na współdziałaniu czterech różnych mechanizmów: odsiewania i bezwzględnego wtłaczania cząstek większych niż 1 µm, elektrostatycznym zatrzymaniu cząstek o wielkości 0, 5 – 1 µm, dyfuzyjnym zatrzymaniem cząstek mniejszych niż 0, 5 µm.

Filtry HEPA nie mogą być regenerowane.

Wyjaławianie za pomocą promieniowania

Promieniowanie nadfioletowe

Najbardziej wrażliwymi drobnoustrojami na działanie promieni nadfioletowych są wegetatywne formy bakterii. Mechanizm działania polega na wywoływaniu zmian w strukturze kwasów nukleinowych. Pod wpływem promieniowania nadfioletowego w komórkach drobnoustrojów powstają dimery tyminy, cytozyny i mieszane dimery cytazynowo – tyminowe. Prowadzi to do błędnego podstawienia zasad w czasie replikacji DNA, a więc do mutacji. Powstałe zmiany mogą uniemożliwić replikacje DNA i w ten sposób powodować śmierć komórki. Niektóre drobnoustroje są zdolne do naprawy DNA uszkodzonego działaniem promieni nadfioletowych. Zakres tego promieniowania niewidzialnego dla oka, które wykazuje działanie bakteriobójcze obejmuje fale o długości 210 – 328 nm. Największą aktywność bakteriobójczą mają fale o długości 254 nm. Źródłem promieniowania nadfioletowego są lampy rtęciowe. Dzięki odpowiednim filtrom emitują ok. 95% promieni o długości fali 254 nm. W zależności od rodzaju lampy okres skutecznego promieniowania bakteriobójczego wynosi zwykle 2,5 – 12 tysięcy h.

Promieniowanie nadfioletowe znajduje zastosowanie przede wszystkim do wyjaławiania powietrza m.in. w pomieszczeniach, w których sporządza się leki w warunkach aseptycznych. Promieniowanie to jest adsorbowane przez szkło i tworzywa sztuczne nie ma ono zdolności przenikania w głąb płynów i ciał stałych. Jego działanie bakteriobójcze ogranicza się głównie do drobnoustrojów znajdujących się w powietrzu i na powierzchni przedmiotów. Nie jest obojętne dla człowieka. Wywołuje stany zapalne skóry i zapalenie spojówek. Lampy UV wykorzystywane są także do wyjaławiania wody oczyszczonej oraz wody do wstrzykiwań będącej w ciągłym krążeniu w systemie zamkniętym. Należy bezwzględnie przestrzegać terminu ważności lampy UV. Zakres emitowania promieniowania jest stały przez określoną liczbę godzin, którą podaje producent. Wyjaławianie promieniami UV jest wyłącznie metodą wspomagającą stosowaną zawsze łącznie z innymi metodami. Skuteczność promieniowania UV zależy od mocy i natężenia lamp bakteriobójczych. Liczba lamp niezbędna do osiągnięcia wymaganej redukcji drobnoustrojów w powietrzu zależy od wielkości pomieszczenia. Najsilniejsze działanie bakteriobójcze występuje w pobliżu lampy i w miarę zwiększania się odległości działanie to słabnie. Drobnoustroje w odległości ok. 3 m od źródła promieniowania nie są praktycznie narażone na poważniejsze uszkodzenia.

Promieniowanie jonizujące:

Promieniowanie jonizujące działa bezpośrednio na kwasy nukleinowe powodując w nich nie tylko mylne podstawienie zasad, lecz także pęknięcia i ubytki. Energia jonizująca wywiera pośredni wpływ na komórki przez zmiany wywołane w środowisku. Produkty radiolizy wody przenikające do komórek mogą przenikać do komórek i mogą powodować zmiany chemiczne jej składników. Źródłem promieniowania jonizującego są akceleratory elektronów i źródła izotopowe. Wyjaławianie promieniami jonizującymi jest metodą z wyboru stosowaną na skalę przemysłową do wyjaławiania materiałów wrażliwych na temperaturę np. różnego rodzaju sprzętu medycznego jednorazowego użytku, opatrunków, materiałów transplantacyjnych. Nie zawsze może być stosowane do wyjaławiania leków ze względu na możliwość powstawania zmian w substancjach leczniczych.

Wyjaławianie za pomocą gazów

Najczęściej stosuje się tlenek etylenu lub formaldehyd. Wg FP VI jest to metoda z konieczności, gdy nie mogą być zastosowane inne metody. Istotnym czynnikiem ograniczającym jest zjawisko sorpcji. Gazów przez wyjaławiany materiał oraz możliwość zachodzenia reakcji chemicznych z wytworzeniem związków toksycznych.

1.      Tlenek etylenu – wykazuje silne działanie bakteriobójcze i wirusobójcze. Jest ono wynikiem alkilowania grup hydroksylowych, karboksylowych i aminowych białek, a także grup aminowych kwasów nukleinowych. W stężeniu 50 g/l niszczy także przetrwalniki.

Tlenek etylenu jest bezbarwnym płynem o temperaturze wrzenia 10,80C. W temperaturze pokojowej jest gazem bezbarwnym o słodkawym eterowym zapachu. Jest łatwopalny i wybuchowy w połączeniu z powietrzem. Można to ograniczyć mieszając 10% lub 20% tlenku etylenu  z CO2 lub N2.

Tlenek etylenu może powodować podrażnienia błon śluzowych oczu, nosa i dróg oddechowych. Mogą też przy tym wystąpić nudności, wymioty. Objawy te ustępują z chwilą ustania jego działania.

Zaletą tlenku etylenu jest przenikliwość przez warstwy tworzyw sztucznych zwłaszcza folie, które służą, jako opakowanie sprzętu i materiałów wyjaławianych tą metodą. Ze względu na możliwość sorpcji tego gazu przez wyjaławiany materiał konieczne jest w tym postępowaniu niezbędny okres desorpcji (oddawania gazu z materiału). W zależności od rodzaju wyjaławianego materiału czas ten wynosi 7 – 30 dni w temperaturze pokojowej. Czas ten można znacznie skrócić stosując odpowiednie urządzenia. Tlenek etylenu znajduje zastosowanie do wyjaławiania różnego rodzaju materiałów i sprzętu medycznego. Z dużym powodzeniem jest stosowany do materiałów wykonanych z tworzyw sztucznych, które ulegają odkształceniu podczas termicznego wyjaławiania (strzykawki, igły, zestawy do pobierania i podawania krwi, cewniki, różnego rodzaju protezy). Tlenek etylenu w wyjątkowych przypadkach jest używany do wyjaławiania niektórych leków.

...