izolacja, barwienie i roznicowanie komorek ukl. immunologicznego.pdf

metody barwienia i różnicowania komórek

układu odpornościowego

Krew

Cele pobierania krwi

Tkanka złożona z elementów morfotycznych

(upostaciowionych) oraz plazmy .

Całkowita objętość krwi krążącej wynosi ok. 5 litrów ,

* Ponad połowę stanowi osocze ,

* 45% krwinki czerwone i ok. 1% krwinki białe i płytki

krwi

• Aby uzyskać surowicę, plazmę , które stanowią materiał badany do różnych

oznaczeń laboratoryjnych tj. oznaczanie poziomu przeciwciał, antygenów

• Aby wyizolować komórki : erytrocyty, leukocyty itp.

W celu wyizolowania komórek, krew pobieramy na substancje

zabezpieczającą krzepnięciu, na tzw. antykoagulant

PLAZMA:

to płyn prawie w całości złożony z wody, zawiera:

witaminy, mikro- i makroelementy, produkty metabolizmu

komórek, a także fibrynogen , nie zawiera komórek

antykoagulant :

EDTA (wersenian dwusodowy)

Cytrynian trójsodowy

Heparyna

OSOCZE:

to plazma w której zawieszone są elementy morfotyczne krwi

SUROWICA:

frakcja krwi pozbawiona zarówno elementów morfotycznych

oraz fibrynogenu i czynników krzepnięcia krwi (pozostałość

po oddzieleniu się skrzepu).

• w przypadku małych zwierząt (myszy, świnki, króliki) krew pobiera się prosto

z serca

• w przypadku zwierząt większych np. owca, krew pobiera się poprzez wkłucie

się do żyły szyjnej

• człowiek - krew obwodową pobiera się zwykle z żyły łokciowej

Komórki krwi

• ERYTROCYTY (krwinki czerwone)

– powstają z retikulocytów, które tracą wszystkie

organelle komórkowe

– kom. bezjądrowe, dwuwklęsłe, Ø 7-8m

– główne zadanie : przenoszenie tlenu i dwutlenku

węgla (dzięki obecności hemoglobiny, która ma

zdolność do nietrwałego wiązania tlenu i

przechodzenia w oksyhemoglobinę)

– mężczyzna ma około 5,4 mln/mm3 erytrocytów w

krwi obwodowej,

– kobieta około 4,5 mln/mm3, noworodek około 7

mln/mm3

Komórki krwi

• ERYTROCYTY c.d.

– krwinki czerwone nie dzielą się , nie mogą pełnić normalnych funkcji

komórkowych, nie mają też mechanizmu, który mógłby naprawiać powstające w

nich z czasem uszkodzenia i po kilku miesiącach (ok. 120 dni) ulegają

zniszczeniu w śledzionie

– ilość erytrocytów w organizmie człowieka może się zmieniać , zależy to m.in. od

miejsca, w którym człowiek się znajduje i ciśnienia jakie tam panuje

• LEUKOCYTY (krwinki białe)

– stosunkowo duże, niemal bezbarwne

– ich zadaniem jest ochrona organizmu przed patogenami

(wirusy i bakterie)

– podstawowy element układu odpornościowego

– liczba waha się od 6-9 tys./mm3

– większe od krwinek czerwonych

– w ich komórkach występuje jądro

(mają swój własny metabolizm i możliwość podziału)

– u dużej części krwinek białych (granulocyty) w cytoplazmie

występuje charakterystyczna ziarnistość (są to lizosomy, które

zawierają enzymy)

– wytwarzane są w szpiku, grasicy, węzłach chłonnych i

śledzionie

– zwiększenie ilości białych krwinek nazywa się

hiperleukocytozą (często, ale nie zawsze powoduje

białaczkę),

– niedobór leukopenią

metody barwienia i różnicowania komórek

układu odpornościowego

Komórki krwi

LEUKOCYTY

PODZIAŁ LEUKOCYTÓW:

• neutrofile [50 - 70%]

– granulocyty obojętnochłonne

– duże komórki Ø 10 -15m

– jądro segmentowane w postaci łańcuszka

mającego zgrubienia (2-5 segmentów)

– zawiera ziarnistości obojętnochłonne

– zapewniają ochronę przed drobnoustrojami

– wytwarzane intensywnie w czasie reakcji zapalnej

– poruszają się ruchem pełzakowatym

– żyją 2-4 dni

– mają właściwości fagocytarne

GRANULOCYTY

MONOCYTY

4-8%

LIMFOCYTY

20-45%

NEUTROFILE

56-73%

BAZOFILE

0-0,5%

EOZYNOFILE

2-4%

Th17

Komórki krwi

PODZIAŁ LEUKOCYTÓW:

• eozynofile [2-5%]

– wzrost liczby - infekcje pasożytniczne, reakcje

alergiczne

– duże komórki Ø 12-16m

– jądro dwupłatowe

– granulocyty kwasochłonne (ich ziarnistości barwią

się barwnikami kwasowymi - eozyna)

– odpowiedzialne za niszczenie obcych białek np.

alergenów, larw i jaj pasożytów

– biorą udział w procesach alergicznych

– poruszają się ruchem pełzakowatym

– zdolności fagocytarne – słabsze niż neutrofile, ze

względu na brak enzymów trawiennych

Neutrofile

Eozynofile

Komórki krwi

PODZIAŁ LEUKOCYTÓW:

• bazofile [ok. 1%]

– duże komórki Ø 10-16m

– żyją krótko, kilka dni

– jądro długie, wygięte w kształcie litery S, zwykle

dwupłatowe

– obecne w krwioobiegu

– nie posiadają zdolności do fagocytozy oraz nie

poruszają się ruchem pełzakowatym

– granulocyty zasadochłonne (ich ziarnistości barwią się

barwnikami zasadowymi) – często przykrywają jądro

komórkowe

– biorą udział w nadwrażliwości typu wczesnego,

• mastocyty

– odpowiednik bazofili w tkankach (głównie tk. łączna)

– zawierają więcej ziarnistości i są większe niż bazofile

– długożyjące i maja zdolność do proliferacji w tkankach

Ulegają degranulacji w odpowiedzi na alergen – wiązanie

krzyżowe między przeciwciałem przyłączony do

receptora na komórce a alergenem

metody barwienia i różnicowania komórek

układu odpornościowego

Komórki krwi

PODZIAŁ LEUKOCYTÓW:

Bazofile

• limfocyty [25%]

– wytwarzane w szpiku kostnym lub w tkankach

limfatycznych (grasica, wyrostek robaczkowy,

węzły chłonne, śledziona)

– główne komórki uczestniczące w powstawaniu odp.

immunologicznej, rozpoznają obce Ag (antygeny) i

odróżniają je od własnych cząstek - autoAg

– należą do agranulocytów

– mają kuliste jądra kom. i okrągły kształt

– heterogenna grupa: limfocyty B i limfocyty T (Th,

Treg, CTL, T17)

– 20% limfocytów jest krótkożyjących ok.3-5 dni,

pozostałe żyją 100-500 dni,

– frakcja limfocytów pamięci immunologicznej żyje

ok. 20 lat

Komórki krwi

Limfocyty

PODZIAŁ LEUKOCYTÓW:

• monocyty [6%]

– największe z leukocytów Ø 12-22m

– kształt jądra: okrągłe do nerkowatego (zajmuje

niemal połowę komórki)

– wytwarzane w szpiku kostnym z monoblastu

– w ciągu doby przechodzą z krwi do tkanek, gdzie

przekształcają się w makrofagi (MØ)

– główne komórki żerne wykazują zdolność do

fagocytozy (cząstki obce i własne Ag)

• makrofagi (MØ)

– dojrzałe monocyty

– zlokalizowane w prawie wszystkich organach

(płuca – m. alweolarne, wątroba – komórki

Kupffera, itp…)

Komórki krwi

Monocyty

• trombocyty (płytki krwi)

– Nie są komórkami (fragmenty komórek pochodzące z

megakariocytów szpiku kostnego)

– brak jądra

– bezbarwne o kształcie dysku lub nieregularnym

– najmniejsze cząstki krwi ściśle związane z procesem

jej krzepnięcia

– wytwarzane są w szpiku kostnym, a ich niewielki % w

płucach

– żyją kilka dni

– dorosły człowiek – 10 11 płytek/dzień

– mogą brać udział w rozprzestrzenianiu się kom.

nowotworowych (poprzez adhezję do tych komórek)

– trombocytopenia – niska liczba płytek,

– trombocytoza – wysoka liczba płytek

metody barwienia i różnicowania komórek

układu odpornościowego

Komórki krwi

Płytki krwi

Układ białokrwinkowy (WARTOŚCI BEZWZGLĘDNE x10 9 /L):

Metody izolowania komórek

Metody izolowania komó rek z narz

rek z narządó w:

Źródła komórek:

• krew obwodowa

• płyny ustrojowe

• tkanki – migdałki, węzły chłonne, grasica, śledziona…

1) mechaniczne

2) enzymatyczne

Wybór metody izolacji komórek opiera się na uwzględnieniu :

• rodzaju komórek, które chcemy wyizolować

• wielkości odzysku uzyskanych komórek

• czystość uzyskanych komórek

Ad.1

Mechaniczne rozdrabnianie wyizolowanych narządów,

homogenizacja (przecieranie na sicie, wytłaczanie),

np. izolowanie leukocytów z grasicy, śledziony,

węzłów chłonnych.

węzły chłonne

Ad.2

Stosowanie enzymów np. trypsyny, powodujących

rozluźnienie tkanki łącznej i uwolnienie komórek do

supernatantu.

grasica

Prawidłowo przeprowadzona izolacja powinna pozwolić na:

• ocenę sprawności funkcjonalnej komórek

• założenie hodowli komórek.

śledziona

Metody izolowania kom

metody barwienia i różnicowania komórek

układu odpornościowego

II.

Metody izolowania frakcji komó rek z krwi obwodowej

rek z krwi obwodowej

Metody izolowania frakcji komó rek z krwi

rek z krwi

obwodowej

Metody biologiczne:

Metody biologiczne :

Metody fizyko-chemiczne :

1- wykorzystanie właściwości fagocytarnych komórek

2- wykorzystanie właściwości adhezyjnych komórek

3- rozdział limfocytów T i B na kolumnach z perełkami szklanymi

lub wełną nylonową

4- technika negatywnej selekcji

5- rozdział komórek za pomocą chromatografii powinowactwa

6- izolacja z narządów in vivo

Ad.3 rozdział limfocyt

limfocytów

Ad. 1 Metoda fagocytarna:

- służy do izolowania komórek monocytarnych z frakcji

monocytaro-makrofagowej i fibroblastów,

- stosuje się kolumny z perełkami lub wełną nylonową

- wykorzystuje się tu także właściwości adhezyjne

- rozdział limfocytów na subpopulacje

- limfocyty B adherują do wełny, a limfocyty T przechodzą z

roztworem przez wełnę

- limfocyty T można odzyskać z wełny poprzez mechaniczne

odpłukiwanie podłożem hodowlanym

- komórki żerne miesza się z karbozydkiem żelaza i przenosi do

zestawu z magnesem,

- potrzebne nam komórki przytwierdzają się do ścianek naczynia,

a zebrany nadsącz odlewamy

Ad. 2 Metoda adhezyjna:

Ad.4 technika negatywnej selekcji

- naturalna adhezja (przyleganie) niektórych komórek do szkła lub

plastiku w temperaturze 37ºC

- komórki te w naturalny sposób odklejają się od tych materiałów w

4ºC

- wykorzystuje się cytotoksyczną surowicę odpornościową oraz

dopełniacz (komplement)

- surowica skierowana jest przeciw określonej frakcji komórek

- następuje liza komórek, które nas nie interesują

Toksyczne przeciwciało + dopełniacz + komórka swoista liza

Ad.5 rozdział kom

chromatografii powinowactwa

- z zastosowaniem złoża np.. Sephadex, (mikrogranulek)

- wykorzystuje się naturalną adherencję komórek, tropizm do Sephadex’u

- można użyć kolumn z przeciwciałami skierowanymi przeciwko określonym

frakcjom komórek

komó rek za pomoc

rek za pomocą chromatografii powinowactwa

Metody izolowania frakcji komó rek z krwi

rek z krwi

obwodowej

Metody biologiczne

Metody fizyko-chemiczne :

Ad.6 izolacja komó rek z narz

vivo

- narządy jako źródło określonych komórek

- można prowokować gromadzenie się komórek w jamach ciała, dotyczy to

głównie zwierząt laboratoryjnych

- źródło limfocytów: grasica, śledziona, węzły chłonne

- źródło granulocytów i monocytów: u zwierząt przez szczepienie

dootrzewnowe neutralnymi substancjami np.. Peptonem. Granulocyty

możemy uzyskać po 4-18 godzinach. Frakcję makrofagową uzyskujemy po 72

godzinach od zaszczepienia

rek z narządó w

w in

in vivo

Sephadex

1- Metoda sedymentacji

2- Izolowanie komórek w gradientach gęstości

3- Metoda adherencyjna

4- Izolacja komórek z zastosowaniem kulek paramagnetycznych

(magnetic beads)

5- Izolacja metodą immunoadsorbcji komórek na fazie stałej (panning)

6- Izolacja przy pomocy sortera komórkowego

Metody izolowania frakcji kom

II.

Metody izolowania frakcji kom

Ad.3 rozdzia

Ad.4 technika negatywnej selekcji

Metody izolowania frakcji kom

Ad.5 rozdzia

Ad.6 izolacja kom

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: