Wykład 4 26.10.2010.pdf

Techniki molekularne

Wykład4

26.10.2010

MetodybadaniabiałekwiążącychDN

-metody identyfikacji wcątecceDNrejonu(rejonów),którymi(i)wiążeibiałko,

-metodyocycaniabiałekwiążącychDN,

-metody badania struktury III-rdowejbiałek wiążącychDN,wtym równieżkompleków

tworącychprebiałkowiąaneDN,

BiałkawiążąceRNmająrównieżpecyficznedomeny

-domena rybonukleoproteinowa – RNO – wytpujenajcciejwbiałkachwiążącychRN,

zidentyfikowano ponad250prypadkówwytpowaniatejdomenywbiałkach,

-domenawiążącadwunicioweRN(dRBD)- wbiałkachwiążącychdwunicioweRN,

-domena Ƙ-homologiczna – wytpujebradko,

Identyfikacja w genomiemiejcwiążącychbiałko

Opracowanowielemetod,dikiktórymmożnaidentyikowaćmiejcawiążącebiałkowobrbie

ragmentówDNdługocikilkutyParaad

Spowolnieniemigracjiżelu – wykorytujeróżnicwtempiemigracjipodcaelektrooreysamego

DNoraDNwkomplekieewiąanymnimbiałkiem

Wpraktycedowiadcenietegotypuwykonujeimieaninąragmentówretrykcyjnych,

obejmującychprypucalnemiejcewiąaniabiałkaMieaninDNłącyiektraktembiałek

jądrowychpowolnioneragmentyidentyikujeipopreporównanieeworemprążków

otrymanychpoelektrooreieamejmieaninyragmentówretrykcyjnychJelinamybiałko

oddiałująceDNtomożemyocyconymbiałkiematąpićektraktbiałekjądrowych

powolnieniemigracjiwżelujetogólnąwkaówką,gdiewekwencjiDNnajdujeimiejce

wiąaniabiałkaBadaniepowolnieniamigracjiwżelujetwic etapempocątkowymipotrebneą

innetechniki,abyotrymywaćdokładniejeinormacje

Tetyochronyprzedmodyfikacją – precyyjniejokrelająpołożeniemiejcwiążącychbiałkoJeli

cąteckaDNjetwiąanabiałkiem,towówcacćekwencjinukleotydowejbdie

chroniona przed modyfikacjami.

Itniejądwapoobywprowadaniatakichmodyikacji

-diałanienukleaą– rocepiawytkiewiąaniafosfodiestrowe wyjątkiemtychchronionych

prebiałko

-podaniediałaniucynnikametylującego,takiegojakiarcandimetylu,którypryłącagrupy

metylowe do G-guaninyWówcażadnaGchronionapredołąconebiałkoniebdiemetylowana

Obydwie metody opierająinaanaliieladów– footprinting.

Wdowiadczenia ZnukleaząDN jetnakowanyiotopemnajednymkońcuiłąconybiałkiem

wiążącymDNdodawanymwektrakciejądrowymlubjakoocyconebiałkoPowtałykomplek

poddajeinatpnie diałaniuDNay1WrotworepootajetylkoragmentDNktórybył

chronionyprewiąanebiałkoNiejettonajleperowiąanieponieważtrudnejet

ekwencjonowanietakmałegoragmentu

Lepiej jetprowadićcciowetrawienienukleaą,takbypojedyncyragmentDNulegałciciu

tylko w jednym miejscu. Po reakcjimamymieaninragmentów,precitychloowowkażdym

możliwymmiejcuawyjątkiemtegogdiepryłącyłoibiałko

PouuniciubiałkarotworuirodieleniuDNnażeluwidimy„drabinkragmentów”

różniącychio1nukleotydPrerwawdrabinceodpowiadamiejcunaDN,którebyłowiąane

białkiem

Test z użyciem DMopierainapodobnejaadiejaktetDNaąFragmentyDNpoddawaneą

nadiałaniuDMomałymtżeniudobranymtak,abywpojedyncymragmencieDN

metylowanaotałatylkojednaguaninaGuaninychronioneprebiałkonieulegająmetylacjiPo

uuniciubiałkanaDNdiałaipiperydyną,któraprecinacąteckwmiejcugdienajdująi

zmodyikowanenukleotydy(jednanić)Próbkipoddajeielektrooreiewwarunkach

denaturującychWórprążkówodpowiadającypoycjomwytkichGporównujemyworem

prążków otrymanychdlakontrolnegoDN,któryniebyłinkubowanyektraktemjądrowymlad

widocnyweworeprążkówtetowanegoDNpokauje,któreGbyłochronione

Tetzakłóceniamodyfikacji– powalaidentyikować nukleotydybeporedniooddiałujące

białkiem– opierainaałożeniu,żejelimienimynukleotydyitotnedlawiąaniabiałka,na

prykładpredodaniegrupymetylowejtowówcauniemożliwimywiąanietegobiałka

JetkilkatakichmetodWynakowanynajednymkońcuragmentDNpoddajeidiałaniu

cynnikamodyikującegonpiarcanudimetyluomałymtżeniudobranym tak by w jednym

ragmencieDNotałametylowanatylkojednaguaninaNatpniedodajeibiałkowiążąceDN

lubektraktjądrowyipreprowadaelektrooreMożnawówcaaoberwowaćdwaprążki–

jedenodpowiadającykomplekowiDN– białko, adrugiDNFragmentDN(niewiąany

białkiem) iolujeiżeluipoddajeidiałaniupiperydynyDługoćragmentuotrymanegopo

ciciupiperydynąwkaujektórynukleotyd(guanina)otałmetylowanyibiereudiałwreakcji

wiąaniabiałkaMożnaatoowaćpodobnetechniki,bytwierdićrównieżktórenukleotydów,

CiTbiorąudiałwwiąaniu

MetodyoczyzczaniabiałekwiążącychDN

PoidentyikowaniuwcątecceDN ekwencjiwiążącejbiałkomożnająwykorytywaćdo

oczyszczania tegobiałka

MetodyocycaniawykorytujądolnocibiałkadowiąaniaokrelonąekwencjąDNnp

chromatograiapowinowactwalubmetodahybrydyacyjna(jelidyponujemybibliotekącDN)

Metodybadaniatrukturybiałekikomplekówbiałekzkwasami nukleinowymi.

OcycaniebiałkawiążącegoDNlubRNdajemożliwoćanaliytrukturyarównoamego

białka,jakibiałkapołąconegoekwencjąnukleotydową

Możnaponaćtrukturtejccibiałka,któraiwiążeDNorabadaćoddiaływaniemidy

cąteckamiGłównymimetodami toowanymiwtymceluą

- krystalografia rentgenowska,

- pektrokopiamagnetycnegoreonanujądrowego(NMR)

Krystalografia rentgenowska – opracowanawkońcuXIXwopierainadyrakcjipromieni

rentgenowkichPromieniowanietomabardomałądługoćal0,01-10nmijettodługoć

porównywalnaodległociamimidyatomamiwcąteckachGdywiąkapromieniotaje

kierowananakrytałtocćprechodiproto,acćmieniakierunekiiropraaJeli

krytałmaregularnątrukturtokolejnepromienieropraająiwpodobnypoóbipowtają

nakładająceikołaObrauykujeinakliyrentgenowkiejlubpecjalnymdetektore

Obraz w postaci serii plamek nazywany jest rentgenogramemdyrakcyjnymtanowionpotawdo

opracowaniatrukturycąteckiponieważwgldneułożeniplamekodwierciedlaułożenie

cątecekwkrytalePoanaliieotrymujemymapgtocielektronowejWprypadkucątecki

białkajettomapaałdowanegopolipeptydunapodtawiektórejmożemyokrelićpołożenieheliα

iharmonijekβorapocególnychgrupRPowalatotworyćtrójwymiarowymodelbiałka

Warunkiemjetuykaniebiałkawormiekrytalicnej,coniekiedyjetbardotrudne

Badaniebiałekwrotworeumożliwiakolejnametoda– NMR- spektroskopia magnetycznego

reonanujądrowego,apreprowadonawpoóbprecyyjnydotarcadanychopodobnej

rodielcocicokrytalograiarentgenowkaMożliwejetanaliowanietylkotounkowomałych

białek

MetodaNMRpocątekXXw(1936r)Metodaopierainaaadie,żeruchobrotowy

naładowanegojądraatomowegowytwaramomentmagnetycnyPopryłożeniuewntrnegopola

magnetycnegowirującejądromożepryjąćjedną2orientacji – αlubβ

WmetodiepektrokopiiNMRokrelaictoćreonanowąbadanegojądranapodtawie

pomiaruenergiipotrebnejdoprejciaetanuαdoβRóżnejądraatomowecharakteryująi

pecyicnądlaiebiectociąreonanowąWartoćtego parametru – ctocireonanowej,

ależyodotoceniawjakimnajdujeijadroidotarcainormacjinatematbudowycątecki

Wikoćbadańbiałekatoowaniemtejmetodyopierainaanaliiejąder 1 H w celu

zidentyfikowania otoczenia każdegoatomuwodoruorawiąańchemicnychłącącychteatomy

innymiMożnawtenpoóbodtworyćtrukturbiałka

Genom – kompletna informacja genetyczna organizmu potrzebna do powstania tego organizmu i do

utrymaniagopryżyciuWprypadkuwyżycheukariotówjettoinGenetZawartaw

haploidalnymetawiechromoomówcharakterytycnychdlagametyWikoćgenomów

budowanajetDN,auniektórychwiruówRN

Rodzajegenomów

- genomywiruów,

- genomyprokariotów,

-organellieukariotów– chloroplastowy, mitochondrialny,

- eukariotycnegenomyjądrowe,

Drogiewolucjigenomów

Wechwiatpowtał14mldlat temu wskutek pierwotnej eksplozji nazwanej Wielkim Wybuchem.

Ok10mldlattemuobłokówgauwyruconegopreWielkiWybuchacłyormowaći

galaktyki, a w naszej galaktyce łońceiplanetyacłykondenowaćok4,6mldlattemu

ZiemipokrywaławodaiwniejpojawiłyipierweytemybiochemicnePocątkowopojawiły

iamoreplikująceipolinukleotydy,bdąceprodkamigenów

Corabardiejłożoneytemyprzedkomórkowepoprediły pojawienieipierwychkomórek

podobnych do dzisiejychbakterii,conatąpiłook3,5mldlattemu,wokreiegdyacłypojawiać

ipierwelądy

Pierwotneoceanyawierałyolemineralnepodobnedowpółcenych,jednakżeupełnieodmienny

byłkładiemkiejatmoery,odmiennebyływwiąkutymgayropuconewoceanachUdiał

tlenuwatmoerewrółdopieropopojawieniuiotoynteyWceniejdominowałymetani

amoniakWykaano,żewyładowaniomelektrycnymwmieaninietychgaówtowaryyyntea

takich jak alanina, glicyna cywalinaPowtawałyrównieżcyjanowodóriormaldehyd,które

ucetnicącwdodatkowychreakcjachprycyniłyidopojawieniainnych aminokwaów oraz

purynipirymidynawmniejymtopniucukrów

Panującawówcanaiemiatmoerapryjałaormowaniupierwychbiocątecek– cątecek

organicznych.

Prypucai,żeróżnegorodajujawikageochemicnedoprowadiłydopolimeryacji

biocątecekTocotałoipóniejpootajeniewyjanione,cylijaknieuporądkowanegobioru

biocątecekdołodouormowaniauporądkowanychgrup,wykaującychprynajmniejniektóre

właciwocibiochemicnychprypiywanychżyciu

Jecedoniedawnaniepotraiononalećwyjanienia,wjakipoóbdołodowpółdiałania

polinukleotydówipolipeptydóworautworeniaamoreprodukującegoiytemu

Białkaniemogąiamereplikować,polinukleotydyamogąireplikowaćiyntetyowaćbiałka,

alepotrebujądotegobiałekPrełomnatąpiłwroku1980,kiedyodkrytoaktywnoćkatalitycną

RNA – rybozymy.

Znaneobecnieryboymykataliują

- cicieautokatalitycne– samowycinanie intronów,

- cicieinnychcątecekRN– np. RNazaP,

- yntewiąańpeptydowych(prowadonaprerRNwryboomach)

Wykaano,żecąteckiRNmogąprowadićynteireplikacjcątecekRNorałącyćeobą

aminokwayanalogicniedoynteypeptydówOnacato,żepierweytemybiochemicne

mogłyopieraćiwcałocinaRN

TeoriawiataRNwydajeobecniebardopójnaiprawdopodobnaCątecki RNpocątkowo

replikowałyprypadkowopryłącająckolejnerybonukleotydynaaadiekomplementarnoci

pontanicniewicpojawiałyiekwencjeoaktywnociryboymówRyboymyumożliwiły

otatecniewikąamokontrolamoreplikacjiDobórnaturalnypromowałnajkutecniej

replikująceiytemyWikadokładnoćreplikacjimogłapowolićnawydłużeniecątecekRN

irowiniciebardiejłożonychwłaciwocikatalitycnych

amoreplikująceicąteckiRNdolnedoprowadeniaprotychreakcji biochemicznych nazwano

protogenomamiReakcjetemogłypolegaćnauwalnianiuenergiiwtrakciewtrakciehydroliywiąań

fosforanowych w ATP i GTP. Po wytworeniubłonlipidowychpowtałypierwetruktury

komórkopodobneeparacjaodrodowikaewntrnegopowalałanawikąkontrol

prowadonychproceów

WjakipoóbwiatopartynaRNewoluowałwkierunkuDN?

Pierwąważnąmianąbyłrowójenymówbiałkowych,któreuupełniały,aotatecnieatąpiły

wikącćaktywnocikatalitycnejryboymówPrejciedokataliybiałkowejwymagało

całkowitejmianyroliprotogenomówwRN,któretałyicąteckamikodującymiJednak

uwaginanietabilnoćwiąaniaoodietrowegowRNdołodoredukcjirybonukleotydówdo

deoksyrybonukleotydów. RNbyłoprypiywaniewproceieodwrotnejtrankrypcjinaDN,a

pryjciepreDNormydwuniciowejumożliwiającej()kopiowanieinaprawukodeń

agwarantowałoukceDN

PierwegenomykładałyiwieluoddielonychcątecekDN,którychkażdaodpowiadała

innemubiałkuPołącenietychodcinkówwpierwechromoomymogłonatąpićarównonaetapie

RNjakiDNUmożliwiałotokontrolnadprekaywanieminormacjigenetycnejpodca

podiałówkomórkowych

NajprawdopodobniejżycienaZiemimuiałopowtaćwicejniżraJednakwytkowkaujenato,

żekomórkibakteryjne,archeonów ieukariontówpochodąodwpólnegoprodkaPrykłademmoże

byćnpdużepodobieńtwokodugenetycnego(niejetjednakowy)Gdybyorganimymiaływicej

niżjednegoprodkatotychkodówbyłobywicej

Najprawdopodobniejprewagykałytemktórypierwyrowiąałdolnoćynteybiałeki

acąłwykorytywaćDN doprekaywaniainormacjigenetycnejOrganimytemiaływiky

potencjałkatalitycnyiwierniejąreplikacj,cymykałyprewagnadpootałymiytemami

KomórkiawierająceDN-RNA-białkomogłyiybciejmnożyćiwygrywałykonkurencjokładniki

odżywce

Danepaleontologicneawierajądowodywkaującenaitnienie:

- pierwychjednokomórkowychglonów1,4mldlat,

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: