Program ćwiczeń z mikrobiologii dla biotechnologów
(II rok)
Metody sterylizacji szkła laboratoryjnego i pożywek mikrobiologicznych.
Podłoża i pożywki mikrobiologiczne.
Praca w warunkach jałowych.
Formy morfologiczne bakterii.
Podział bakterii na gram ujemne i gram dodatnie. Barwienie komórek bakteryjnych.
Budowa komórki bakteryjnej.
Wpływ czynników fizykochemicznych na bakterie.
Metody hodowli bakterii – w podłożu płynnym, hodowla beztlenowców
Posiew na szereg biochemiczny- badanie właściwości biochemicznych wybranych pałeczek jelitowych
Morfologia kolonii bakteryjnych na różnych podłożach mikrobiologicznych.
Oznaczanie wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki (antybiotyki, sulfonamidy, fitoncydy, bakteriocyny)
Bakteriofagi- oznaczanie wrażliwości bakterii na bakteriofagi, miano lizatu fagowego, streak-test.
Podstawowe odczyny serologiczne.
Baketrie z rodzajów Neisseriae i Corynebacterium
Ziarniaki a,b,g-hemolizujące.
Ćwiczenie 1
Zapoznanie studentów z instrukcją BHP
I. Metody hodowli mikroorganizmów - rodzaje podłoży mikrobiologicznych (DEMONSTRACJA):
a) podłoża płynne i stałe
b) podłoże zwyczajne (LA - Luria agar), wybiórczo-różnicujące (MacConkey’a, Chpmana), wybiórcze (selektywne; Sabouroda).
Mamy do dyspozycji sześć probówek z jałowym bulionem.
probówki: 1, 2, 3 należy zaszczepić hodowlą nocną Escherichia coli (po 100ml),
probówki: 4, 5, 6 zaszczepić hodowlą nocną Bacillus subtilis (po 100ml).
a) probówki 1 i 4 jałowić w autoklawie przez 30 min. w temp. 121oC
b) probówki 2 i 5 jałowić w aparacie Kocha przez 30 minut.
c) probówki 3 i 6 - nie jałowić (kontrola).
Probówki inkubować w wytrząsarce w 37oC przez 24 godziny, a następnie schować do lodówki. Wyniki doświadczenia będą omówione na następnych ćwiczeniach. Hodowle wyjściowe badanych bakterii również zostaną przechowane do następnych ćwiczeń w celu wybarwienia przetrwalników i wykonania preparatów mikroskopowych.
III. Sterylizacja przez sączenie (DEMONSTRACJA)
IV. Posiew bakterii na podłoże stałe:
a) posiew redukcyjny Escherichia coli - każdy student wykonuje posiew na podłożu LA
b) posiew w postaci murawy – każda para wysiewa na podłoże LA
- 0,1 ml hodowli E. coli
- 0,1 ml hodowli Bacillus subtilis (do wyboru bakterie po autoklawowaniu, po gotowaniu w aparacie Kocha, hodowle kontrolne)
c) łapanie bakterii z powietrza każda para ma do dyspozycji 1 płytkę
d) posiew na skos E. coli.
e) posiew na słupek E. coli.
Każda para ma do dyspozycji 6 płytek LA
opalić ezę
Inkubacja w odpowiednich warunkach
Posiew redukcyjny
Wzrost bakterii
V. Obserwacja wzrostu mikroorganizmów, morfologia kolonii na podłożach stałych i płynnych
a) podłoże Chapmana - (Staphylococcus, Micrococcus sp.)
b) podłoże McConkeya (E. coli - lac+, Serratia marcescens).
c) podłoże Sabourouda (Candida sp., E. coli).
d) Agar wzbogacony
Pałeczki
E.coli, Erwinia lejąca się, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella anatum, Klebsiella oxytoca, Flavobacterium okeanokoites, Enterobacter spp. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp. Brunatny, Pseudomonas spp.( Fluoryzujący), Xanthomonas,
Laseczki
Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus spp.
Ziarniaki
Micrococcus sp, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Gafkya tetragena, Sarcina spp.
Drożdzaki
Candida sp. Candida albicans.
Bakterie dnia:
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus spp.
WIADOMOŚCI TEORETYCZNE.
1. Mycie i sterylizacja szkła laboratoryjnego.
a) szkło nowe - posiada odczyn zasadowy - eliminacja przez zanurzenie w 1% HCl lub 15 minutowe gotowanie.
b) szkło używane - 24h moczenie w chromiance (dwuchromian potasu, kwas siarkowy i woda).
Sterylizacja - (łac. sterylis - jałowy) - proces zabicia drobnoustrojów (formy wegetatywne i przetrwalnikowe).
Metody sterylizacji:
a) fizyczne - sterylizacja cieplna (sucha) lub z parą wodną,
sterylizacja UV,
sterylizacja promieniami jonizującymi,
sterylizacja ultradźwiękami.
b) mechaniczne (filtracja),
c) chemiczne (dezynfekcja).
Ad a) Sterylizacja cieplna-sucha:
* wyżarzanie (ezy, igły, skalpele)
* opalanie (brzeg probówki, bagietki)
* suszenie (szkło laboratoryjne)
140oC - 2,5h, 170oC - 1,0h
Sterylizacja parą wodną
* gotowanie (strzykawki, instrumenty chirurgiczne)
* autoklawowanie (pożywki)
0,7 atm. - 117oC; 3,0 atm - 134oC
* jałowienie w aparacie Kocha (pożywki do 100oC).
Pasteryzacja - stosowana w celu zniszczenia form wegetatywnych w płynnych środkach spożywczych (np. w mleku) - jednorazowe podgrzanie do 60-80oC.
Tyndalizacja - pasteryzacja frakcjonowana. Niszczy formy wegetatywne i przetrwalnikowe –
3-krotna pasteryzacja w odstępach 24h.
Sterylizacja UV (długość fali 250nm) - uszkadza strukturę kwasów nukleinowych (DNA) - stosowana do sterylizacji pomieszczeń, naczyń z tworzyw sztucznych i plastikowych. Najmniej odporne są zarodniki pleśni.
Ultradźwięki - fale dźwiękowe powyżej 20 tys. Hz - metoda oparta na zjawisku kawitacji. Polega na rozrywaniu roztworu przez powstanie w nim pęcherzyków gazów, co prowadzi do mechanicznego rozerwania komórek od wewnątrz. Metodą tą nie można zabić przetrwalników.
Ad b) Filtracja (podłoża płynne np. surowica, roztwór mocznika, witaminy) - przy filtracji często stosuje się podciśnienie.
* filtry z ziemi okrzemkowej (Berkefelda),
* filtry z porcelany (Chamberlanda),
* filtry teflonowe
* filtry ze spiekanego szkła (schotta),
* filtry membranowe (molekularne) - z pergaminu, żelatyny, błon zwierzęcych (zatrzymują wirusy).
Ad c) Dezynfekcja (chemiczna metoda sterylizacji) - jest to proces oczyszczania powierzchni stołów, narzędzi od drobnoustrojów zdolnych wywołać zakażenie (nie niszczy form przetrwalnych).
Na siłę działania środków bakteriobójczych (dezynfekujących) mają wpływ następujące czynniki:
* rodzaj i wrażliwość drobnoustrojów,
* czas działania środka chemicznego,
* temperatura środowiska,
* stężenie środka dezynfekującego.
Środki dezynfekujące pomieszczenia i przedmioty:
* kwasy i zasady - 10% roztwory zasad, mleko wapienne - niszczą przedmioty
* środki utleniające - po zetknięciu z komórkami drobnoustrojów wydzielają zjonizowany tlen, w wyniku czego następuje uszkodzenie struktury błon cytoplazmatycznych (niszczą też przetrwalniki - działają tak jak ozon). Podchloryny, chloraminy, jodyna (10% roztwór jodu), 3% woda utleniona.
* sole metali ciężkich (głównie srebra i rtęci) - precypitacja i inaktywacja białek.
* organiczne związki dezynfekujące:
- alkohole - denaturacja białek.
- fenole i krezole - trucizny protoplazmatyczne - wchodzą w reakcje ze ścianą komórkową (niszczą formy wegetatywne bakterii i grzybów, na przetrwalniki oddziaływają słabo). Przykłady: fenol, lizol, formaldehyd.
* detergenty - czwartorzędowe związki amoniowe (posiadają dużą aktywność powierzchniową) - łączy się je z chlorowcami. Uszkadzają błony komórkowe, ale nie niszczą spor. Przykłady: Zephirol, Desogen, Sterinol.
Środki dezynfekujące powietrze - gazy, para, aerozole - glikol propylenowy, trietylenoglikol, podchloryn sodu, sterinol, kwas mlekowy.
Siłę działania związku dezynfekcyjnego określa się przez porównanie jego działania do działania fenolu - tzw. współczynnik fenolowy (stosunek największego rozcieńczenia badanego związku zabijającego mikroorganizmy w ciągu 10 min. do największego rozcieńczenia fenolu zabijającego mikroorganizmy w 10 min.
2. Pożywki i podłoża mikrobiologiczne.
Pożywki (podłoża) - płynne lub zestalone mieszaniny złożone z odpowiednio dobranych składników, służących hodowli drobnoustrojów in vitro (w szkle).
Pożywki muszą:
a) zawierać związki odżywcze (pierwiastki biogenne C,N,O,H,S,P). Jako Źródła węgla, azotu, aminokwasów i witamin stosuje się pepton. Jest to produkt enzymatycznej hydrolizy białek za pomocą pepsyny i HCl. Jest to mieszanina proteaz, polipeptydów i aminokwasów.
b) mieć odpowiednie pH (z reguły 7,2-7,4).
c) być jałowe,
d) obyć izotoniczne (podobne ciśnienie jak w komórkach drobnoustrojów, zwykle uzyskuje się przez dodanie soli NaCl). Podłoże hipotoniczne (o niższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) powoduje pęcznienie komórek, a nawet ich pękanie. W podłożu hipertonicznym (o wyższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) następuje kurczenie się plazmy komórkowej i oddzielanie od ściany komórkowej (plazmoliza).
e) być jednorodne.
Podział pożywek ze względu na charakter składników:
* naturalne (wyciąg z krwi, z tkanek roślinnych i zwierzęcych, mleko),
* syntetyczne (mieszanina substancji organicznych i nieorganicznych),
* półsyntetyczne (mieszane).
Podział pożywek ze względu na wymagania odżywcze drobnoustrojów:
* proste - bulion odżywczy, agar odżywczy.
* złożone - jak wyżej plus witaminy, substancje wzrostowe itp. Wśród nich wyróżnia się:
- podłoża selektywne (wybiórcze) - które zawierają 1 lub 2 składniki hamujące rozwój drobnoustrojów, które chcemy wyeliminować z hodowli.
- podłoża różnicujące (identyfikacyjne) - zawierają charakterystyczną substancje, która jest enzymatycznie rozkładana wyłącznie przez określone gatunki drobnoustrojów.
Autotrofy - nie wymagają do wzrostu związków organicznych.
Prototrofy - wymagają do wzrostu 1 związku organicznego (rosną na ubogich pożywkach).
Heterotrofy - wymagają do wzrostu obecności w pożywce związków organicznych: (cukry - Źródło węgla), (aminokwasy - żądło azotu), witamin i innych.
Auksotrofy - to heterotrofy, które potrzebują poza jednym stosunkowo prostym związkiem organicznym, jeszcze co najmniej jednego związku organicznego, jak np. aminokwasy lub witaminy.
Hypotrofy - bezwzględne pasożyty - bytują w organizmie gospodarza.
Podział pożywek ze względu na konsystencję:
- płynne (bulion, podłoże mineralne, brzeczka).
- stałe (zestalone) - agar, podłoże żelatynowe.
- półpłynne - zawierają 0,15-0,2% agaru.
Agar - wielocukier zawierający galaktozę, resztę siarczanową, jony Ca+2 i Mg+2 (uzyskuje się go z krasnorostów). Rozpuszczalny w wodzie w temperaturze 95 - 99oC, krzepnie zaś w temperaturze 45 - 49oC. Tylko nieliczne bakterie morskie i glebowe go rozkładają. W środowisku kwaśnym ulega hydrolizie i traci zdolność do tworzenia żelu.
żelatyna - białko proste otrzymywane z chrząstek. Rozpuszcza się w ciepłej wodzie, a w temperaturze 25oC tworzy galaretowaty żel. Jest upłynniana i rozkładana przez bakterie i grzyby wytwarzające enzymy proteolityczne (hydrolizujące białko). Nie nadaje się do hodowli drobnoustrojów, ale ma zastosowanie do badania proteolitycznych właściwości drobnoustrojów.
Podłoże McConkey - zawiera sole żółci, które hamują rozwój większości bakterii. Na bazie tego podłoża przygotowuje się pożywkę wybiórczą i różnicującą.
*wybiórcza - dezoksycholan sodu pozwala na rozwój pałeczek z rodzaju Enterobacteriae (żyjące w przewodzie pokarmowym człowieka) i Enterocoki.
*różnicująca - zawiera laktozę i wskaźnik barwny - czerwień obojętną. Bakterie lac+ (rozkładają laktozę - zmiana zabarwienia pożywki na kolor fioletowy), bakterie lac- (bez zmian).
Podłoże Chapmana - dla gronkowców.
*wybiórcza - wysokie stężenie NaCl (7,5%) - hamuje rozwój większości drobnoustrojów (rosną gronkowce).
*różnicująca - mannitol 1% - substancja diagnostyczna i różnicująca. Część gronkowców rozkłada mannitol i następuje zmiana pH pożywki, a w efekcie obserwujemy zmianę zabarwienia (wskaźnik barwny - czerwień fenolowa).
Podłoże Sabourouda - podłoże do hodowli drożdży i grzybów.
*wybiórcza - niskie pH (4,4 - 4,5) i obecność glukozy.
OBSERWACJE I WNIOSKI.
Zagadnienia teoretyczne.
Czym są drobnoustroje? Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne. Do czego służą podłoża mikrobiologiczne. Czym jest czysta kultura danego drobnoustroju, czym jest kultura mieszana. Rodzaje pożywek mikrobiologicznych: płynne i stałe; naturalne, syntetyczne i półsyntetyczne; minimalne, pełne, wzbogacone i specjalne (różnicujące, wybiórcze = selektywne, wybiórczo-różnicujące); Czym jest i do czego służy agar. Jakie warunki powinna spełniać pożywka mikrobiologiczna, aby zapewnić warunki, optymalne dla wzrostu badanych mikroorganizmów? Autotrofy i heterotrofy; prototrofy i auksotrofy.
Co oznacza: sterylizacja = jałowienie, pateryzacja, tyndalizacja, dezynfekcja, sanityzacja, aseptyka, antyseptyka - w jakim celu je się wykonuje? Jakie są sposoby sterylizacji (fizyczne, chemiczne, mechaniczne?. Do czego służą: autoklaw i aparat Kocha. W jaki sposób jałowi się: wodę i roztwory soli i pożywki (lub składniki pożywek) termostabilne (odporne na wysoka temperaturę); w jaki sposób sterylizuje pożywki lub składniki pożywek wrażliwe na wysoką temperaturę (termolabilne). W jaki sposób sterylizuje się szkoło laboratoryjne, narzędzia metalowe, pomieszczenia laboratoryjne. Przykłady zastosowania dezynfekcji. Rodzaje posiewów bakteriologicznych. W jakim celu wykonuje się posiew redukcyjny. Co oznacza termin „inokulacja”. Co wiesz o bakteriach Escherichia coli i Bacillus sp.
Ćwiczenie 2
Materiał do ćwiczeń
E.coli, Erwinia chrysanthemii - lejąca się, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella anatum, Klebsiella oxytoca, Flavobacterium okeanokoites, Enterobacter spp. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp. Brunatny, Pseudomonas spp.( Fluoryzujący), Xanthomonas,Citrobacter freundii
...
kacpi60