Część wstępna pracy magisterskiej

pani Kamilli Bronisz

wykonanej pod kierunkiem prof. Adama Patkowskiego

Poznań 2003

1. Wstęp

Tematem mojej pracy magisterskiej jest „Badanie struktury i dynamiki polielektrolitów przy pomocy spektroskopii korelacji fluorescencji i dynamicznego rozpraszania światła”. Badania przeprowadzone zostały przy pomocy spektrometru ConfoCor2, który od stycznia 2001 r. jest dostępny w Zakładzie Biofizyki Molekularnej.

W pierwszej części pracy omówione zostało zjawisko fluorescencji, następnie przedstawiono podstawy teoretyczne oraz biofizyczne pomiarów wykorzystujących zjawisko fluorescencji, kolejny rozdział zawiera opis jednej z metod pomiaru fluorescencji - spektroskopię korelacji fluorescencji, część ostatnia zawiera wyniki badań.

Spektroskopia korelacji fluorescencji jest jedną z metod, która pozwala na analizę próbek o bardzo niskim stężeniu. W odróżnieniu od innych metod fluorescencyjnych    w spektroskopii korelacji fluorescencji uwaga skupiona jest nie na natężeniu emisji własnej fluorescencji, ale raczej na spontanicznych fluktuacjach natężenia fluorescencji znakowanych barwnikami obiektów, spowodowanych przez niewielkie fluktuacje liczby cząstek w objętości czynnej. Poniższy poglądowy rysunek prezentuje zasadę przeprowadzania pomiaru przy pomocy SKF

Rys. 1.1. Zasada przeprowadzania pomiarów przy pomocy SKF.

Od lewej przedstawiony jest kształt objętości czynnej (objętości konfokalnej), następnie cząstki znakowane barwnikiem fluoryzującym znajdujące się w tejże objętości i emitujące fotony fluorescencji. Czasowy zanik fluktuacji natężenia sygnału fluorescencji jest opisywany przy pomocy funkcji korelacji fluorescencji omówionej szczegółowo w rozdziale 3.

W technikach dynamicznego rozpraszania światła dynamikę  badanych próbek odzwierciedlają fluktuacje natężenia światła rozproszonego. Stosunkowo niewielka wydajność zjawiska rozpraszania oraz jego powszechność powodują, że techniki rozproszeniowe wymagają stosunkowo dużych objętości i stężenia preparatu. W zastosowaniach biochemicznych np. w wyznaczaniu konformacji nowopoznanych białek, takie ilości preparatu są wręcz nieosiągalne, co często kończy współpracę specjalistów z dziedziny rozpraszania światła z pracowniami biochemicznymi.

Od wady tej wolna jest spektroskopia korelacji fluorescencji, w której dzięki użyciu mikroskopu konfokalnego objętość oświetlana promieniem lasera maleje do pojedynczych femtolitrów, a wymagane stężenie jest rzędu nanomola. Tę wspaniałą wydajność zapewnia zjawisko fluorescencji, które dodatkowo wprowadza bardzo dobrą selektywność mierzonego sygnału. W tradycyjnych badaniach rozproszeniowych często spora część mierzonego sygnału pochodzi od różnego rodzaju zanieczyszczeń obecnych w kuwetce pomiarowej pomimo usilnych prób starannego oczyszczenia preparatu.       W spektroskopii korelacji fluorescencji widać wyłącznie znakowane cząsteczki,           co eliminuje konieczność oczyszczania preparatu.

Technika spektroskopii korelacji fluorescencji pozwala na badanie procesów asocjacji, przede wszystkim w odniesieniu do ważnych cząsteczek biologicznych (receptory białkowe, fragmenty DNA), oraz badanie własności fizykochemicznych ośrodków z otoczenia  lub wnętrza żywej komórki. Dzięki dobrej lokalizacji pomiaru można mierzyć ruchliwość cząsteczek w określonych miejscach wewnątrz komórki                lub wewnątrz różnego rodzaju tkanek.

Głównym przeznaczeniem spektrometru ConfoCor2 jest pomiar ruchliwości cząsteczek znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi (lub samych barwników) w dobrze zdefiniowanym, niewielkim obszarze o wymiarach rzędu jednego mikrometra. Jako wynik otrzymuje się bezwzględną wartość współczynnika dyfuzji translacyjnej w przestrzeni 3- wymiarowej lub 2- wymiarowej np na powierzchni błony lipidowej lub cienkiej warstwy.

Pomimo, iż pomiary przy pomocy SKF nie dają tak dokładnych pomiarów współczynnika dyfuzji translacyjnej jak tradycyjne pomiary rozproszeniowe, w zamian jednak za to technika ta oferuje możliwości pomiarów wielkości bardzo trudno mierzalnych innymi metodami. Pozwala ona m in. na  pomiary

·  specyficzności nowych leków,

·  reakcji enzymatycznych, w których enzym i substrat tworzą kompleksy,

·  reakcji wiązania się białek do kwasów nukleinowych,

·  reakcji wiązania komplementarnych fragmentów DNA (możliwość stwierdzenia chorób genetycznych),

·  reakcji wiązania różnego rodzaju cząsteczek do receptorów komórkowych (testy alergiczne) [4].

Najistotniejszym zjawiskiem z punktu widzenia spektroskopii korelacji fluorescencji jest, jak sama nazwa mówi, fluorescencja. Kolejny rozdział przybliży podstawy tego procesu.

2. Luminescencja.

2.1. Podział luminescencji.

Świecenie ciał ogrzanych do wysokich temperatur nazywamy emisją ciał rozżarzonych. Wszystkie inne rodzaje promieniowania nazywamy luminescencją  [8]. Polega więc ona na świeceniu nietermicznym, a bodźcami pobudzającymi do zimnego świecenia mogą być światło, energia elektryczna, chemiczna, energia powstająca przy rozkładzie radioaktywnych pierwiastków jak również energia mechaniczna. Ciała podatne na występowanie w nich zjawiska luminescencji noszą ogólnie nazwę luminoforów. W zależności od energii bodźca wyróżniamy odpowiednio: elektroluminescencję, chemiluminescencję, radioluminescencję, mechanoluminescencję oraz fotoluminescencję. Schematyczny podział luminescencji pokazuje poniższy rysunek.

Rys. 2.1. Podział luminescencji.

Elektroluminescencja jest świeceniem ciał pobudzonych energią elektryczną       np. świecenie lampy jarzeniowej lub lasera półprzewodnikowego. Zjawisko                  to w pierwszym przypadku wywołane jest działaniem prądu elektrycznego przechodzącego przez zjonizowany gaz, w drugim powstaje w wyniku przejścia prądu elektrycznego przez półprzewodnik.

Z często obserwowanych przykładów można wymienić katodoluminescencję, czyli świecenie gazów rozrzedzonych w czasie przepływu przez nie prądu elektrycznego (neony). W laboratoriach medycznych spotykamy się z elektroluminescencją w postaci świecenia ekranów różnego rodzaju lamp oscyloskopowych, na których dokonuje się obserwacji przebiegu potencjałów bioelektrycznych (ekg, eeg i podobne). Ekrany te, podobnie jak ekran telewizora pokryte są od wewnątrz substancją fluoryzującą pod wpływem padających na nią elektronów.

Chemiluminescencja występuje w czasie reakcji chemicznych związanych najczęściej z utlenianiem. Pewną odmianę chemiluminescencji stanowi bioluminescencja, polegająca na świeceniu pewnych narządów różnych zwierząt (robaczki świętojańskie, „fosforescencja” mórz i oceanów). Osobną odmianą chemiluminescencji jest termoluminescencja. Pojawia się ona w przypadku, gdy            w trakcie ogrzewania zamrożonej substancji zachodzą reakcje chemiczne między reaktywnymi cząstkami. Tryboluminescencję obserwujemy w trakcie kruszenia niektórych ciał stałych, które emitują światło w wyniku powstawania statycznych ładunków elektrycznych, wytworzonych przez tarcie, a sonoluminescencję – w wyniku działania silnych fal dźwiękowych.

Luminescencja występuje tak w ciałach stałych, jak i cieczach i gazach.               W zależności od złożoności procesu emisji światła wyróżniamy dwa typy fotoluminescencji – fluorescencję  i fosforescencję. Fluorescencja zachodzi,                gdy elektron przechodzi bezpośrednio ze stanu wzbudzonego do stanu o niższej energii. Fosforescencja jest procesem bardziej złożonym. W tym przypadku wzbudzony atom lub cząsteczka nim przejdzie do stanu podstawowego, znajdzie się w stanie metatrwałym o czasie życia dłuższym niż 10-8s. Opóźniona fluorescencja, która zanika znacznie wolniej niż zwykła, „szybka” fluorescencja tej samej cząsteczki, pojawia się    w wyniku kilku różnych mechanizmów, z których najlepiej poznanymi są: anihilacja tryplet- tryplet i termicznie aktywowana fluorescencja opóźniona [6].

Czas wygaszania fluorescencji jest zazwyczaj krótszy niż fosforescencji i często służy, (choć nie jest to zbyt ścisłe) za postawę do odróżnienia obu tych zjawisk. Czas życia fluorescencji może się zawierać w granicach od ns do kilku dni [8]. W związku z tym, iż fluorescencja jest zjawiskiem niezwykle rozpowszechnionym w badaniach spektroskopowych zostanie ona szczegółowo przeanalizowana w kolejnym podrozdziale. 

W zjawisku fotoluminescencji słuszna jest na ogół reguła Stokesa, która głosi,     że długość fali lp światła pobudzającego ciało do świecenia powinna być mniejsza      od długości fali le światła luminescencji. Jeśli energia fotonu pobudzającego Ep= hnp,    a energia fotonu emitowanego podczas luminescencji Ee=hne, to hne= hnp-W,              stąd wynika, że lp< le. Dzieje się tak dlatego, ponieważ część energii (W), jaką atom lub cząsteczka uzyskały podczas wzbudzenia, zostaje w zderzeniach przekazana innym cząsteczkom (tzw. przejścia bezpromieniste).

2.2. Fluorescencja.

Często można stwierdzić, zwłaszcza w przypadku dużych i sztywnych układów    w fazach skondensowanych, że widma fluorescencji, wykreślone w skali częstości (energii), stanowią w przybliżeniu lustrzane odbicia widm absorpcji (rys. 2.3, 2.4). Zważywszy, że  w temperaturze pokojowej absorpcja zachodzi z poziomu S0(0) stanu podstawowego,  a emisja, na skutek bardzo szybkiej relaksacji oscylacyjnej – z poziomu S1(0) stanu wzbudzonego, istnienie symetrii zwierciadlanej sugeruje duże podobieństwo różnic energii pomiędzy poziomami oscylacyjnymi w obu stanach elektronowych.

Każdy układ fizyczny dąży do stanu, w którym jego energia przyjmuje wartość minimalną, czyli do stanu równowagi. Wyobraźmy sobie molekułę, która zaabsorbowała energię, będzie ona dążyła do jej oddania, a tym samym do osiągnięcia stanu równowagi termicznej, czyli do osiągnięcia temperatury jednakowej w każdym elemencie objętości układu. Obsadzenie poziomów energetycznych możemy opisać przy pomocy funkcji rozkładu energii Boltzmanna:

Rys. 2.2. Obsadzenie poziomów energetycznych w molekule. Funkcja rozkładu energii Boltzmanna [1].

nw/ nn oznacza stosunek liczby molekuł na wyższym poziomie energetycznym Ew  i niższym En, czyli stosunek obsadzeń energetycznych w temperaturze T, k – stała Boltzmanna  =1.38*10-23 J*K-1.

Dwa podstawowe mechanizmy pozbywania się zaabsorbowanej energii                         to bezpromieniste (konwersja wewnętrzna, przejścia interkombinacyjne) i promieniste (fluorescencja, fluorescencja opóźniona, fosforescencja)  przekazywanie energii otoczeniu . Pierwsze z nich odbywa się w zderzeniach (zbliżeniach) molekuł, ponieważ średnia energia, rzędu kT, jest zbliżona do odstępów poziomów energetycznych rotacyjnych i oscylacyjnych,  drugie zaś polega na emisji fotonu.

Molekularno-kinetyczna teoria gazów pozwala określić czas pomiędzy zderzeniami molekuł. W gazie o małych molekułach pod ciśnieniem atmosferycznym czas ten wynosi 10-10 sekundy. W cieczach sens zderzeń, raczej zbliżeń, jest mniej jasny, ale oceniono, że czas między zderzeniami molekuł wynosi 10-13 sekundy.

Energia rotacyjna jest bardzo łatwo przekazywana w zderzeniach i prawie wszystkie zderzenia są efektywne. Częstości rotacji są rzędu 1011 – 1012 s-1 , czyli         w gazie w ciągu 10*9-10 s między kolejnymi zderzeniami molekuła zdąży wykonać 10-100 obrotów, a w cieczy w ciągu 10-13 s nie zdąży wykonać między zderzeniami          ani jednego obrotu.

Energia oscylacyjna nie jest w zderzeniach tak łatwo przekazywana jak energia rotacyjna. Ocenia się, że na dziesięć tysięcy zderzeń jedno jest efektywne. W takim zderzeniu energia oscylacyjna przekształca się w energię rotacyjną i translacyjną obu zderzających się molekuł. Wynika z tego, że czas życia na wzbudzonym poziomie oscylacyjnym jest rzędu 10-9 sekundy. Częstości oscylacji są rzędu 1013 – 1014 s-1, a więc w czasie 10-9 s molekuła zdąży wykonać bardzo wiele drgań.

Dlatego to widma oscylacyjne można obserwować w cieczach, natomiast widma rotacyjne i oscylacyjno-rotacyjne obserwujemy tylko w gazach.

Energia wzbudzenia elektronowego jest zbyt duża, aby molekuła mogła się jej      w tak łatwy bezpromienisty sposób pozbyć w zakresie niewysokich temperatur. Dominuje więc mechanizm promienisty i molekuła po pewnym czasie życia                 na elektronowym poziomie wzbudzonym emituje pochłonięty foton. To zjawisko, jak już wcześniej wspomniano, nazywamy luminescencją.

Najważniejsze dla spektroskopii wzbudzenie elektronowe spowodowane absorpcją promieniowania elektromagnetycznego jest przyczyną emisji zwanej fluorescencją.    Na rys. 2.3. pokazano najprostszy przypadek absorpcji i emisji elektronowej – fluorescencji.

Rys. 2.3. Krzywe energii potencjalnej stanów elektronowych podstawowego i wzbudzonego oraz przejścia emisyjne i absorpcyjne.

Przed absorpcją prawie wszystkie molekuły w temperaturze pokojowej znajdują się na zerowym poziomie oscylacyjnym podstawowego poziomu elektronowego.         Po pochłonięciu fotonu molekuły mogą się znaleźć na którymś z poziomów oscylacyjnych wzbudzonego poziomu elektronowego. Przejście elektronowe jest bardzo szybkie, trwa ok. 10-15 s, okres oscylacji jest natomiast rzędu 10-13 s; skąd wywiedziono regułę Francka– Condona, w myśl, której w czasie przejścia elektronowego nie zdąży się zmienić odległość r między zrębami atomowymi lub innymi słowy, ponieważ jądra są znacznie cięższe od elektronów, przejścia elektronowe zachodzą znacznie szybciej, niż jądra są w stanie na nie zareagować [16]. Dlatego też strzałki oznaczające przejścia elektronowe przebiegają pionowo na rys.2.3. Mogą się one kończyć na różnych poziomach oscylacyjnych elektronowych stanów wzbudzonych. Pasmo absorpcyjne powinno mieć strukturę oscylacyjną, której składowe odzwierciedlają odstępy poziomów oscylacyjnych na wzbudzonym poziomie elektronowym. Powrót do podstawowego stanu elektronowego jest utrudniony i molekuła „żyje” przez pewien czas we wzbudzonym stanie elektronowym. W tym czasie oddaje w sposób bezpromienisty w zderzeniach nadmiar energii oscylacyjnej i schodzi do zerowego poziomu oscylacyjnego na wzbudzonym poziomie elektronowym. Ze wzbudzonego poziomu wraca do podstawowego poziomu elektronowego w sposób promienisty, przy czym może się zatrzymać na różnych poziomach oscylacyjnych podstawowego poziomu elektronowego. Pasmo fluorescencji powinno więc również mieć strukturę oscylacyjną, ale odległości składowych będą odzwierciedlać tym razem odstępy poziomów oscylacyjnych na elektronowym poziomie podstawowym.

Zwraca uwagę fakt, że strzałki przejść fluorescencyjnych są krótsze niż strzałki przejść absorpcyjnych, z wyjątkiem strzałek przejścia między oscylacyjnymi poziomami 0-0, które są sobie równe. Oznacza to, że pasmo fluorescencji leży w obszarze niższych częstości (dłuższych fal) niż pasmo absorpcyjne. Stąd wywodzi się reguła Stokesa,        w myśl której długości fali promieniowania fluorescencyjnego są większe od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję lub co najwyżej im równe[1].

Z powyższych rozważań wynika, iż widma fluorescencji, wykreślone w skali częstości (energii), stanowią w przybliżeniu lustrzane odbicia widm absorpcji. Doświadczenia wykazały, że rzeczywiście tak jest zwłaszcza w przypadku dużych i sztywnych układów sztywnych fazach skondensowanych (rys.2.4, 2.5).

Rys.2.4. Schemat układu wzajemnych położeń pasm absorpcji, fluorescencji i fosforescencji.

Rys. 2.5. Widmo absorpcji i widmo fluorescencji fenyloalaniny [2].

Na rys.2.3 przedstawiono modelowe widma absorpcji i emisji elektronowej natomiast  przykładowe widmo absorpcji i fluorescencji fenyloalaniny na rys. 2.4. Energia fotonów fosforescencji jest niższa od energii fotonów fluorescencji, a ta z kolei jest niższa od energii zaabsorbowanych fotonów. Z tego względu widma te są przesunięte względem siebie. Ponadto widmo absorpcyjne jest bardziej strome po stronie fal dłuższych, natomiast widma fluorescencji i fosforescencji po stronie fal krótszych. Poza tym, jak już wcześniej wspomniano, widma absorpcji i fluorescencji są swoimi zwierciadlanymi odbiciami. Sposób powstawania jednego i drugiego widma pozwala to wytłumaczyć, jeżeli uwzględni się fakt, że poziomy energii oscylacyjnej w miarę jej wzrostu zagęszczają się (rys. 2.6.).

Rys. 2.6. Przejścia w cząsteczce przy absorpcji fotonów i przy fluorescencji [2].

2.3 Diagram Jabłońskiego.

Aleksander Jabłoński wybitny polski fizyk jest twórcą schematu przejść elektronowych, który w literaturze światowej nosi nazwę schematu (diagramu) Jabłońskiego. Diagram ten idealnie odzwierciedla procesy zachodzące w molekule po zaabsorbowaniu energii (rys.2.7).

Rys. 2.7. Schemat Jabłońskiego. Poziomy energii elektronowej: S0, S1 – singletowe, T1 – tripletowe; 0, 1, 2, 3 – poziomy energii oscylacyjnej; a1, a2 – absorpcja fotonów; F – fluorescencja, Ph – fosforescencja; IC( internal conversion) – przejścia bezpromieniste, ISC (inter system crossing) – przejścia międzysystemowe [2].

Schemat poziomów Jabłońskiego stanowi uproszczony układ kilku najniższych stanów elektronowych i oscylacyjnych, w jakich może znaleźć się molekuła. Zaznaczone są na nim stany elektronowe cząsteczki (poziomy energii elektronowej): singletowe (S0, S1) i trypletowe (T1) oraz związane z nimi poziomy energii oscylacyjnej (oznaczone cyframi). Stan podstawowy- S0, w którym energia elektronowa jest najmniejsza, jest prawie zawsze stanem singletowym, a przejścia singlet- tryplet, czyli    z odwróceniem spinu są zabronione. Poziomów energii rotacyjnej (leżącej pomiędzy poziomami energii oscylacyjnej) nie zaznaczono – dla przejrzystości rysunku, a także, dlatego że nie są one istotne przy wyjaśnianiu interesujących nas zjawisk fizycznych.  W stanach singletowych (S) wypadkowy spin wszystkich elektronów w cząsteczce jest równy 0 (multipletowość 2S+1=1), natomiast w stanach trypletowych (T) (może być ich więcej, ...