BIOTECHNOLOGICZNA MODYFIKACJA BIOLOGICZNYCH WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK ZBÓŻ.pdf

YWNO . Nauka. Technologia. Jako , 2005, 4 (45), 17 - 26

BARTOSZ BRZOZOWSKI, WŁODZIMIERZ BEDNARSKI,

MAREK ADAMCZAK

BIOTECHNOLOGICZNA MODYFIKACJA BIOLOGICZNYCH

WŁA CIWO CI BIAŁEK ZBÓ

S t r e s z c z e n i e

Przedstawiono wła ciwo ci biologiczne peptydów otrzymywanych z białek zapasowych ziarniaków

zbó . Wskazano na sekwencje aminokwasów w peptydach uwalnianych z białek m.in. zbó

wykazuj cych aktywno biologiczn . Przedstawiono udział peptydów w reakcjach alergicznych

prowadz cych do takich chorób, jak celiakia czy astma. Scharakteryzowano funkcje epitopów peptydów

izolowanych z białek zbó odpowiedzialnych za reakcje alergiczne. Omówiono funkcje transglutaminazy

w przemianach białek w blaszkach wła ciwych jelita. Wskazano na potencjalne zastosowanie enzymów

(transglutaminazy, peptydaz prolinowych) i mikroorganizmów (bakterii fermentacji mlekowej zakwasu

chlebowego) w redukcji alergenno ci peptydów pochodzenia ro linnego. Scharakteryzowano

biotechnologiczne metody zmniejszania alergenno ci białek ziarniaków zbó .

Słowa kluczowe: białka, zbo a, alergeny, transglutaminaza, peptydazy prolinowe

Wprowadzenie

W analizie przyczyn alergenno ci niektórych białek zbó zwraca si m.in. uwag

na produkty ich hydrolizy w surowcach oraz technologii ich przetwarzania. Niezb dna

jest wiedza o aktywno ci proteaz na ka dym z wymienionych etapów oraz o

wła ciwo ciach biologicznych produktów enzymatycznej degradacji białek. W

opracowaniu przedstawiono obecny stan wiedzy o biologicznie aktywnych peptydach

pochodzenia ro linnego oraz sposobach ich enzymatycznej modyfikacji w celu

eliminacji cech niepo danych, w tym tak e immunoreaktywno ci.

Białka s podstawow i integraln cz ci ywno ci. S ródłem energii i

aminokwasów niezb dnych do wzrostu ywego organizmu. Ponadto dzi ki swoim

wła ciwo ciom fizykochemicznym mog pełni ró ne funkcje w ywno ci.

Dr in . B. Brzozowski, prof. dr hab. W. Bednarski, dr in . M. Adamczak, Katedra Biotechnologii

ywno ci, Wydz. Nauki o ywno ci, Uniwersytet Warmi sko-Mazurski, ul. J. Heweliusza 1, 10-719,

Olsztyn,

e-mail: Bartosz.Brzozowski@uwm.edu.pl

Bartosz Brzozowski, Włodzimierz Bednarski, Marek Adamczak

Dodatkowo wiele białek ma specyficzne wła ciwo ci biologiczne. Wła ciwo ci te

nieobecne w spo ywanej ywno ci mog si uaktywnia w czasie procesów

trawiennych zachodz cych w przewodzie pokarmowym. Peptydy uwalniane z białek

przez enzymy proteolityczne mog wykazywa wła ciwo ci regulatorowe podobne do

tych, jakie wykazuj hormony [20] lub wła ciwo ci alergizuj ce [34].

Z charakterystyki enzymów proteolitycznych zbó wynika, e proteazy s obecne

w ziarnach w stanie spoczynku, uaktywniaj c si podczas kiełkowania. Ponadto, cz

enzymów jest syntetyzowana w czasie kiełkowania [26]. Proteazy hydrolizuj białka

zapasowe uwalniaj c peptydy i aminokwasy wykorzystywane przez zarodek do

wzrostu. Modyfikuj one skład i wła ciwo ci uwalnianych peptydów mog cych sta

si potencjalnym ródłem bioaktywnych zwi zków regulatorowych. Ponadto

udowodniono, e białka zbó obecne w ywno ci i trawione w przewodzie

pokarmowym mog by ródłem alergennych peptydów [24].

Bioaktywne peptydy

Najpowszechniejszym ródłem bioaktywnych peptydów s białka mleka [20], ale

wyst puj one tak e w białkach jaj, ryb czy białkach ziaren takich ro lin, jak: soja,

kukurydza, ry , pszenica [3]. Poznano fizjologiczn aktywno peptydów

otrzymywanych podczas hydrolizy in vivo i in vitro białek zapasowych zbó [13].

W sekwencjach białek mog wyst powa fragmenty o aktywno ci przeciw-

nadci nieniowej, opioidowej, antagonistycznej w stosunku do opioidowej, immuno-

modulacyjnej, antybakteryjnej i antywirusowej, przeciwutleniaj cej, wi cej i

transportuj cej metale, antyamnezyjnej, powoduj cej skurcze mi ni gładkich i

przeciwkrzepliwej [20, 23]. Aktywno biologiczna uwalnianych peptydów wynika z

ich specyficznej sekwencji aminokwasów.

Miyoshi i wsp. [25] wyizolowali z kukurydzy poddanej działaniu termolizyny

inhibitor enzymu konwertuj cego angiotensyn (inhibitor ACE), wpływaj cy na

regulacj ci nienia krwi w organizmach ludzi. Inhibitor ACE był izolowany tak e z

białek zapasowych ry u (glutenin i prolamin) i soi (11S glycinina, 7S konglycynina)

[27]. Z białek ry u, glutenin i prolamin, wyizolowano peptydy o działaniu

przeciwnadci nieniowym [20].

ródłem bioaktywnych peptydów mog te by białka pszenicy. Fukudome

i wsp. [12] wyizolowali z białek glutenu, w wyniku trawienia enzymatycznego,

peptydy o aktywno ci opioidowej zwane egzorfinami. W ród tych peptydów egzorfina

GE-B5, o sekwencji aminokwasowej YGGWL, wykazywała najwi ksz aktywno in

vitro i antagonizm do m i d receptorów opioidowych. W porównaniu z L-enkefalin

o sekwencji YGGFL, ró ni cej si jedn reszt aminokwasow , egzorfina GE-B5

wykazywała aktywno opioidow ni sz 1,2- i 4,2-krotnie w stosunku do receptorów

m i d oraz ni sze powinowactwo odpowiednio 1,2- i 1,7-krotnie [12].

BIOTECHNOLOGICZNA MODYFIKACJA BIOLOGICZNYCH WŁA CIWO CI BIAŁEK ZBÓ

Peptydy o aktywno ci morfinowej uwalniane z glutenu przez hydroliz in vivo

przez oł dkow proteinaz i pepsyn wykazywały odporno na działanie trypsyny

i chymotrypsyny [36]. Sugeruje si , e peptydy te nie s dalej trawione i w

niezmienionej postaci przenikaj barier jelita. Niektóre peptydy mog by

absorbowane bez degradacji z przewodu pokarmowego do krwi. Zioudrou i wsp. [36]

udowodnili, e peptydy te maj zdolno do przenikania bariery krew-mózg i ł czenia

si z receptorami opioidowymi w mózgu, jak i innych organach wewn trznych.

Alergeny zbó

Mills i wsp. [24] wskazuj na nast puj ce grupy ro linnych alergenów, które

mog uczula poprzez układ pokarmowy: prolaminy, 2S albuminy, niespecyficzne

białka enzymatyczne transferuj ce lipidy (nsLTP), kupiny, proteazy cysteinowe i

serynowe oraz inhibitory a-amylazy i trypsyny.

Białka alergenne wykryto w pszenicy, j czmieniu, ycie, owsie, a tak e w

kukurydzy, sorgo i gryce [24]. Jednym z najcz ciej znanych objawów alergenno ci

białek zbo owych jest zespół chorób okre lonych nazw celiakii. Nietolerancja

okre lonych frakcji białek zapasowych zbó mo e prowadzi tak e do astmy, zmian

dermatologicznych i wywołanego wiczeniami fizycznymi szoku anafilaktycznego

[34].

Badania przyczyn celiakii wykazały, e jest ona wywoływana mi dzy innymi

spo yciem produktów zawieraj cych białka pszenicy, a przede wszystkim glutenu

[28]. To jedna z najcz stszych i podstawowych chorób genetycznych. Jej dokładny

mechanizm nie jest znany, jednak wiadomo, e to wła nie gluten inicjuje ła cuch nie w

pełni poznanych reakcji, wywołuj c aktywacj układu immunologicznego

u predysponowanych genetycznie osób [14].

Gluten zawiera dwie grupy białek: monomerowe gliadyny i polimerowe

gluteniny, ale tylko te pierwsze uwa a si za odpowiedzialne za reakcje uczuleniowe

[21]. Białka glutenu maj nietypowy skład chemiczny. Zawieraj one du e ilo ci

prolaminy (P) i glutaminy (Q), odpowiednio ok. 15 i 35% reszt aminokwasowych [7].

Budowa chemiczna proliny i glutaminy powoduje, e wi zania peptydowe utworzone

przy udziale tych aminokwasów w ła cuchu polipeptydowym s odporne na działania

enzymów proteolitycznych przewodu pokarmowego człowieka.

Procesy trawienia białek glutenu uwalniaj wiele peptydów i polipeptydów. Shan

i wsp. [30] prowadzili enzymatyczn hydroliz in vitro rekombinowanej a2-gliadyny

(b d cej odpowiednikiem a-gliadyny) uzyskuj c m.in. 33-merowy peptyd bogaty

w prolin i glutamin . Peptyd ten był odporny na działanie proteaz. Analiza sekwencji

aminokwasów tego peptydu wykazała obecno epitopów: PFPQPQLPY,

PQPQLPYPQ, PYPQPQLPY oraz WQIPEQSR odpowiedzialnych za reakcje z

Bartosz Brzozowski, Włodzimierz Bednarski, Marek Adamczak

komórkami CD4 + T i białkami HLA-DQ2 lub HLA-DQ8, b d cymi mediatorami w

reakcjach immunologicznych u pacjentów chorych na celiaki . Wymienione epitopy

w swej sekwencji zawieraj co najmniej jedn reszt glutaminy, b d cej substratem

w reakcji z transglutaminaz . Proces deaminacji tych reszt jest istotny w stymulowaniu

komórek T. Odł czenie grupy amonowej od glutaminy powoduje wytworzenie

ujemnego ładunku odpowiedzialnego za ł czenie si z białkami HLA-DQ2 [1]. St d

sugestie, e trawienie enzymatyczne białek glutenu w przewodzie pokarmowym, a

nast pnie modyfikacja uwolnionych peptydów przez transglutaminaz odgrywa

krytyczn rol w patogenezie celiakii [22].

Mcl Mowat [22] zaproponował hipotetyczny schemat interakcji mi dzy glutenem

a systemem immunologicznym u chorych na celiaki . Z glutenu poddanego trawieniu

enzymami proteolitycznymi uwalniane s peptydy o okre lonej sekwencji, bogate

w prolin i glutamin . Peptydy te przenikaj barier jelita i s poddane działaniu

transglutaminazy w blaszkach wła ciwych, w wyniku czego od reszt glutaminy po

deaminacji zostaj odł czone grupy amonowe. Tak zmodyfikowany peptyd

rozpoznawany jest przez komórki T i białka HLA-DQ2 lub HLA-DQ8, wywołuj c

reakcje immunologiczne, powoduj ce aktywacj -interferonu i mechanizmów

odpowiedzialnych za zanik kosmków jelitowych i hyperplazi uchyłków jelita.

U osób chorych na celiaki obecno frakcji gliadynowych w organizmie

wywołuje reakcje immunologiczne objawiaj ce si m.in. wysokim poziomem

przeciwciał IgA i IgG w surowicy krwi [28]. Alergenno prolamin zbó zale y od

zawarto ci i sekwencji aminokwasów. Tanabe i wsp. [32] badali wła ciwo ci struktury

pierwszorz dowej glutenu i wykazali, e najkrótszym peptydem zdolnym do reakcji z

przeciwciałami IgE jest peptyd o sekwencji QQQPP. Ensari i wsp. [10] podaj , e

tetrapeptydy o sekwencji PSQQ, PQQP lub QQQP s charakterystyczne dla peptydów

alergennych w celiakii. Badania in vivo 12 i 13-merowych oligopeptydów uzyskanych

z N-ko ca ła cucha a-gliadyny (reszty aminokwasowe 3-96) wykazały aktywno

oligopeptydów tylko w przypadku wyst pienia sekwencji PQQP.

Badania proteomiczne białek zbó wykazały obecno w -gliadynie pszenicy,

-sekalinie yta i C hordeinie j czmienia oktapeptydu PQQPFPQQ odpowiedzialnego

za reakcje alergiczne [10]. Wyznaczona sekwencja aminokwasów zawiera motyw

PQQP charakterystyczny dla a-gliadyny. Ponadto Cornel i Mothes [5] sugeruj , e

obecny we frakcjach motyw QQPY wywołuje celiaki . Arentz-Hansen i wsp. [1]

wykazali immunoreaktywno epitopu peptydów w 57-75 regionie a-gliadyny.

Kolejne badania tych autorów [2] dowiodły, e T-komórki CD4+ rozpoznaj trzy

peptydy bogate w prolin i glutamin o sekwencjach: PFPQPQLPY, PQPQLPYPQ i

PYPQPQLPY otrzymane z regionu a-gliadyny. Region ten reaguje z przeciwciałami u

pacjentów chorych na celiaki .

BIOTECHNOLOGICZNA MODYFIKACJA BIOLOGICZNYCH WŁA CIWO CI BIAŁEK ZBÓ

Inn postaci alergii wywołanej kontaktem z białkami zbó jest astma. Gomez

i wsp. [16] wyizolowali i oczy cili ró ne antygeny zwi zane z uczuleniami na m k

pszenn i j czmienn , reaguj ce z przeciwciałami IgE. Alergeny o masach

cz steczkowych od 12·10 3 do 15·10 3 Da nale ały do grupy inhibitorów a-amylazy i

trypsyny. Z kolei Armentia i wsp. [4] scharakteryzowali dwa dominuj ce alergeny w

j czmieniu i pszenicy. Były to glikozydowe pochodne tetramerowych inhibitorów a-

amylazy: CM16 z pszenicy i CMb z j czmienia oraz monomerowy inhibitor BMAI-1 z

j czmienia. Inhibitory a-amylazy uwalniane podczas procesów trawienia w

przewodzie pokarmowym tak e wykazuj działanie alergizuj ce. James i wsp. [17]

wydzielili z ziaren pszenicy frakcj białkow o masie cz steczkowej 15·10 3 Da

wywołuj c reakcje uczuleniowe. Tsuji i wsp. [34] tak e wyizolowali z białek

pszenicy inhibitory a-amylazy CM16 i CM17 o masach cz steczkowych 17·10 3 Da

b d ce glikoproteinami. Sugeruj oni, e kluczow rol w reakcjach alergicznych

mo e odgrywa reszta glikozydowa. Kimoto i wsp. [19] badali serum 65 pacjentów

wra liwych na białka m ki pszennej i wykryli 15 antygenów rozpoznawanych przez

przeciwciała IgE. Alergeny o masach cz steczkowych (27, 31 i 47)·10 3 Da były

głównymi alergenami w pszenicy.

ródłem alergenów mog by tak e inhibitory a-amylazy i trypsyny oraz białka

j czmienia. Alergeny zawarte w j czmieniu mog przechodzi do produktów

wytworzonych przy jego udziale, np. do piwa. Figueredo i wsp. [11] wyizolowali z

piwa polipeptyd o masie cz steczkowej 38·10 3 Da rozpoznawany przez przeciwciała

IgE. Podobnie Curioni i wsp. [6] wyizolowali polipeptyd o masie cz steczkowej 16·10 3

Da b d cy alergenem w j czmieniu i obecny w piwie.

Mo liwo ci redukcji alergenno ci białek zbó

Zmniejszeniu immunoreaktywno ci białek zbó sprzyja stosowanie enzymów lub

mikroorganizmów zdolnych do degradacji alergennych peptydów. Wiadomo, e za

alergenno białek zbó odpowiadaj uwalniane z nich peptydy przewa nie bogate

w prolin i glutamin . Ich eliminacja powinna polega na dalszej degradacji lub

wytworzeniu dodatkowych izo-wi za poprzez ł czenie reszt aminokwasowych

blokuj cych glutamin . W rozwi zaniu tego problemu pomocne s dwie grupy

enzymów: transglutaminazy oraz peptydazy prolinowe.

Transglutaminaza (EC.2.3.2.13) to ogólna nazwa enzymu R-glutaminyl-peptyd-g-

glutamyltransferazy. Enzym ten bierze udział w reakcjach katalitycznych m.in.

przenosi reszty aminokwasowe (-e-aminoacylowe) w specyficzne miejsce g-amidowe,

tworz c wi zanie peptydowe z glutamin , katalizuje reakcje: deaminacji w miejscu g-

amidowym, nitrozylacj i denitrozylacj grup –SH cysteiny, przył czania aminy lub

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: