WPŁYW pH I CHLORKU SODU NA DENATURACJĘ CIEPLNĄ OKSY- I METHEMOGLOBINY.pdf

YWNO . Nauka. Technologia. Jako , 2004, 4 (41) S, 62 – 71

MARIA WALCZYCKA, TADEUSZ KOŁCZAK

WPŁYW pH I CHLORKU SODU NA DENATURACJ CIEPLN

OKSY- I METHEMOGLOBINY

S t r e s z c z e n i e

Celem bada było okre lenie wpływu pH oraz dodatku chlorku sodu na denaturacj ciepln oksy- i

methemoglobiny krwi bydl cej.

Otrzyman z krwi bydl cej oksyhemoglobin przekształcano w methemoglobin , stosuj c utlenianie

barwnika przy u yciu sze ciocyjano elazianu(II) potasu. Okre lano temperatur denaturacji obu form

barwnika hemowego krwi w roztworach wodnych o pH = 5,0 – 7,0 oraz w roztworach o pH = 5,6 i pH =

6,8, zawieraj cych dodatek NaCl w st eniach od 0 do 6%. Do oznaczania zastosowano analiz widm

absorpcji ogrzewanych roztworów barwnika. Zanik pików absorpcji charakterystycznych dla danej formy

barwnika był wska nikiem jego denaturacji cieplnej. Warto pH roztworu miała istotny wpływ na

temperatur denaturacji zarówno oksy-, jak i methemoglobiny. Temperatura denaturacji obu form

barwnika rosła wraz ze wzrostem warto ci pH roztworu. Zale no temperatury denaturacji od pH

roztworu była wi ksza w przypadku oksyhemoglobiny ni methemoglobiny. W roztworach o pH 5,4-5,8

oba barwniki ulegały denaturacji w temp. od 64 do 66 o C. Dodatek NaCl do roztworu barwników obni ał

temperatur ich denaturacji, ale znacznie wi kszy spadek temperatury denaturacji zachodził w roztworach

o pH= 5,6 ni w roztworach o pH = 6,8.

Słowa kluczowe: oksyhemoglobina, methemoglobina, denaturacja cieplna, pH, chlorek sodu.

Wprowadzenie

Hemoglobina, czerwony barwnik hemowy wyst puj cy w erytrocytach zwierz t,

działa przy yciowo jako przeno nik tlenu we krwi oraz odgrywa decyduj c rol w

transporcie dwutlenku w gla i jonów wodorowych [19, 23]. Po wykrwawieniu

zwierz cia w czasie uboju, w jego narz dach wewn trznych i mi niach szkieletowych

pozostaje zmienna ilo hemoglobiny. Jej zawarto w tkankach zale y od stopnia

wykrwawienia. Upust powy ej 50% krwi kr cej przyjmowany jest za wska nik

dobrego wykrwawienia. Krew zostaje zatrzymana głównie w takich narz dach

wewn trznych, jak: serce, w troba, płuca i przewód pokarmowy. Wska nikiem

wielko ci resztkowej krwi w mi niach jest stosunek hemoglobiny do mioglobiny

Dr in . M. Walczycka, prof. dr hab. in . T. Kołczak; Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierz cych,

Wydział Technologii ywno ci, Akademia Rolnicza w Krakowie, Al. 29 Listopada 52; 31-425 Kraków

e-mail: mariawalczycka@poczta.onet.pl

WPŁYW pH I CHLORKU SODU NA DENATURACJ CIEPLN OKSY- I METHEMOGLOBINY ...

(barwnika hemowego mi ni). Najwi cej krwi pozostaje w mi niu sercowym –

hemoglobina stanowi ponad 50% barwników hemowych, najmniej w mi niach o

przewadze białych włókien mi niowych – poni ej 10% ogólnej ilo ci barwników

hemowych [11]. Przemiany, jakim ulega hemoglobina w czasie składowania oraz

ogrzewania krwi i mi sa wpływaj na ich barw , jako i przydatno przetwórcz .

Hemoglobina mo e wyst powa w surowcach rze nych w formie zredukowanej

w postaci purpurowoczerwonej dezoksyhemoglobiny i jasnoczerwonej

oksyhemoglobiny oraz w formie utlenionej w postaci brunatnej methemoglobiny.

Wzajemny stosunek wymienionych form barwnika zale y od dost pno ci tlenu (lub

powietrza), aktywno ci redukuj cej wewn trznego rodowiska oraz obecno ci

czynników utleniaj cych [3, 5]. Bezpo rednio po wykrwawieniu zwierz cia

hemoglobina w pozyskanej krwi wyst puje w postaci oksyhemoglobiny. Dopiero gdy

ci nienie parcjalne tlenu zmniejszy si do warto ci poni ej 3,5 kPa, ponad 50%

oksyhemoglobiny ulega dysocjacji do dezoksyhemoglobiny [7]. Do czynników

sprzyjaj cych procesowi utleniania obu postaci zredukowanej hemoglobiny nale

obecno soli, oddziaływnie promieniowania wietlnego i ultrafioletowego, a tak e

warto pH [15, 23]. W rodowisku o pH mniejszym od 5,0 wszystkie formy

hemoglobiny ulegaj rozkładowi do składowych hemu i globiny [12, 22].

Krew wykorzystywana jako surowiec w produkcji krwistych przetworów

mi snych jest wst pnie ogrzewana. Pod wpływem podwy szonej temperatury

hemoglobina ulega denaturacji cieplnej do szarobr zowego barwnika

globinohemichromogenu. Według Pezackiego [21] krew powinna by wst pnie

ogrzewana do temp. 80 o C. W dost pnej literaturze nie spotkano informacji

dotycz cych temperatury denaturacji hemoglobiny i wpływu na ni ró nych

czynników technologicznych i rodowiskowych. Kilka bada po wi cono natomiast

stabilno ci cieplnej mioglobiny. Stwierdzono, e stabilno cieplna mioglobiny zale y

od wła ciwo ci jako ciowych surowca, charakteru ligandu w szóstej pozycji

koordynacyjnej pier cienia porfirynowego hemu i stopnia utlenienia elaza [9, 24].

Stopie denaturacji mioglobiny zwi ksza si ze wzrostem temperatury ogrzewania [8].

Według Wrighta [27], znacz ca ilo mioglobiny mi sa wołowego ulega denaturacji w

temp. ni szej ni 60 o C. Zdaniem Lawrie’ego [13], mioglobina ulega całkowitej

denaturacji w temp. wy szej ni 80 o C. Według Lytrasa i wsp. [14], po ogrzaniu mi sa

wołowego do temp. 70 o C pozostaje tylko 1% rozpuszczalnej niezdenaturowanej

mioglobiny. Najbardziej termostabiln postaci mioglobiny jest metmioglobina [17].

W wy szych zakresach pH stopie denaturacji cieplnej mioglobiny jest mniejszy [26].

Dodatek soli powoduje obni enie temperatury denaturacji barwnika [25, 14].

Celem bada było okre lenie wpływu pH oraz dodatku chlorku sodu na

denaturacj ciepln oksy- i methemoglobiny krwi bydl cej.

Maria Walczycka, Tadeusz Kołczak

Materiał i metody bada

Materiałem do otrzymywania wodnych roztworów oksyhemoglobiny i

methemoglobiny była wie a krew pobierana w czasie wykrwawiania krów rze nych

w zakładzie mi snym Krakmeat w Krakowie. Krew pobierano do polietylenowych

pojemników zawieraj cych niewielk ilo heparyny. Krew wirowano w wirówce K-

24 firmy Janetkzy (Niemcy) w temp. 4 o C przy 5 000 g przez 10 min. Osad czerwonych

krwinek przemywano 5-krotnie 0,9% roztworem NaCl i hemolizowano przy u yciu

wody redestylowanej, dodaj c do 1 obj to ci krwinek 5 obj to ci wody. Hemolizat

s czono pod zmniejszonym ci nieniem przez warstw Cellite 330 o grubo ci 2 cm.

Oznaczano pH hemolizatu oraz, po odpowiednim rozcie czeniu wod , dokonywano

pomiaru widm absorpcji. Warto pH oczyszczonych hemolizatów wynosiła 6,80-6,82.

Maksima absorpcji w zakresie widma widzialnego wyst powały przy długo ciach fali

540 nm i 578 nm. Na podstawie przebiegu krzywych absorpcji przyj to zgodnie z

McLoughlin [16],

e otrzymane hemolizaty s roztworami wodnymi

oksyhemoglobiny.

Oksyhemoglobin w wodnym roztworze, otrzyman w powy szy sposób,

utleniano do methemoglobiny zgodnie z metod opisan przez Millara i wsp. [18]. W

tym celu w 50 cm 3 nierozcie czonego hemolizatu rozpuszczano 520 mg

sze ciocyjano elazianu(II) potasu – K 4 [Fe(CN) 6 ]. Otrzymany roztwór s czono w

warunkach podci nienia przez warstw elu Sephadex G-25 o rednicy 3 cm i grubo ci

10 cm. Po odpowiednim rozcie czeniu filtratu wod dokonywano pomiaru widma

absorpcji. Maksima absorpcji filtratów w zakresie widma widzialnego wyst powały

przy długo ciach fali 500 nm i 632 nm. Na podstawie przebiegu krzywych absorpcji

przyj to zgodnie z MacLean [15], e otrzymane filtraty s wodnymi roztworami

methemoglobiny.

W celu okre lenia temperatury denaturacji cieplnej barwników oczyszczone

hemolizaty (oksyhemoglobina) i filtraty (methemoglobina) rozcie czano wod

redestylowan odpowiednio: roztwory oksyhemoglobiny do otrzymania warto ci

współczynnika absorpcji przy długo ci fali 540 nm w zakresie E 1 cm = 0,4–0,5,

roztwory methemoglobiny do otrzymania warto ci współczynnika absorpcji przy

długo ci fali 500 nm w zakresie E 1 cm = 0,6-0,7.

Analiza wpływu pH na denaturacj ciepln barwników obejmowała zakres

warto ci 5,0–7,0. Wybrane warto ci pH s charakterystyczne dla mi sa wołowego o

wła ciwych cechach jako ciowych oraz krwi w okresie po wykrwawieniu zwierz cia.

dane pH ustalano, dodaj c do rozcie czonych roztworów barwników: 0,05 M kwas

cytrynowy (pH < 6,0) lub 0,5 M NaH 2 PO 4 (pH > 6,0). Warto ci pH roztworów

ró nicowano co 0,2 jednostki.

W celu okre lenia wpływu NaCl na denaturacj ciepln barwników próbki

przygotowywano w nast puj cy sposób: do rozcie czonych roztworów barwników o

pH = 5,6 oraz 6,8 dodawano NaCl ( in substancja ) do uzyskania st enia soli w

WPŁYW pH I CHLORKU SODU NA DENATURACJ CIEPLN OKSY- I METHEMOGLOBINY ...

roztworach w zakresie 0–6%, przy czym st enie soli w kolejnych roztworach ró niło

si co 1%.

Temperatur denaturacji okre lano na podstawie analizy widm absorpcji w czasie

podgrzewania roztworów. W tym celu rozcie czony roztwór barwnika o znanym pH,

i/lub st eniu soli, wlewano do kuwety o grubo ci 1 cm. Kuwet umieszczano w

komorze spektrofotometru UV-VIS Scanning Spectrophotometer, typu 210,

wyposa onego w przystawk TCC-260 (firmy Shimadzu) z ogrzewaniem i kontrol

temperatury roztworu. Zapisu widm absorpcji dokonywano, podnosz c temp. roztworu

w kuwecie co 2 o C w zakresie 20–60 o C, a nast pnie co 1 o C do temp. 70 o C.

Temperatur , w której obserwowano zanik pików absorpcji charakterystycznych dla

danej formy barwnika, przyjmowano za temperatur jego denaturacji.

Badania przeprowadzono na wodnych roztworach obu barwników hemowych

krwi w trzech niezale nych powtórzeniach.

Do interpretacji wyników zastosowano analiz wariancji, a obliczenia wykonano

przy u yciu programu Statistica 5.1.

Wyniki i dyskusja

Przykładowy zapis widm absorpcji roztworu oksyhemoglobiny o pH = 5,6 w

temp. 20 o C, powy ej 50 o C i w temp. denaturacji przedstawiono na rys. 1.

Zanik pików absorpcji w zakresie widma widzialnego obu analizowanych form

hemoglobiny był rezultatem ich precypitacji w roztworze po ogrzaniu do okre lonej

temperatury. Według Lawrie’go [13], brak jest jednoznacznej opinii czy mo na

traktowa wytr canie barwników hemowych pod wpływem temperatury jako wska nik

ich denaturacji cieplnej. Trout [25] uwa a, e temperatura w jakiej precypituj

barwniki hemowe w mi sie jest temperatur ich denaturacji cieplnej. Kieruj c si

opini Trouta [25], precepitacj analizowanych form hemoglobiny w roztworze

wodnym, po jego podgrzaniu do okre lonej temperatury, przyj to w niniejszej pracy

jako wska nik denaturacji badanych barwników.

Na rys. 2. przedstawiono wyniki pomiaru temperatury denaturacji oksy- i

methemoglobiny krwi w zale no ci od warto ci pH wodnego roztworu barwników.

Temperatura w jakiej ulegały denaturacji oksyhemoglobina i methemoglobina była

zale na od warto ci pH. W przypadku oksyhemoglobiny zale no ta była wi ksza

szczególnie w ni szych warto ciach pH. W roztworze o pH 5,0 oksyhemoglobina

denaturowała w temp. 57,3 o C, w roztworze o pH 5,2 – w 60,3 o C, w roztworach o pH w

zakresie 5,4–6,6 – w temp. 64–66 o C, natomiast w pH = 6,8 oraz w pH = 7,0 –

odpowiednio w temp. 67 o C i 68 o C. Natomiast methemoglobina denaturowała w

roztworze o pH = 5,0 w temp. 61,6 o C, a w roztworach o pH 5,2–7,0 w zakresie temp.

64–66 o C.

Maria Walczycka, Tadeusz Kołczak

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

500

520

540

560

580

600

Długo fali [nm]

Długo fali / Wave length [nm]

Rys. 1. Przykładowy zapis widm absorpcji roztworu oksyhemoglobiny o pH = 5,6 w temp. 20 o C ( –– ),

powy ej 50 o C (––) i w temp. denaturacji ( – – ).

Fig. 1. An example of absorbance spectra of a solution of oxyhaemoglobin showing a pH value = 5.6 at

t = 20 o C ( –– ), t > 50 o C (––), and at a denaturation temperature ( – – ).

Stwierdzona ni sza temperatura denaturacji analizowanych barwników

hemowych krwi, szczególnie oksyhemoglobiny, w bardziej kwa nym rodowisku jest

zgodna z wynikami, jakie uzyskano w przypadku mioglobiny, barwnika hemowego

mi ni [4, 6, 10, 20, 26]. Wi ksza odporno na temperatur ogrzewania

methemoglobiny, szczególnie w roztworach o ni szych warto ciach pH, potwierdza

opini , e utlenione formy barwników hemowych s bardziej odporne na ogrzewanie

[17].

Na rys. 3. i 4. przedstawiono wyniki obrazuj ce wpływ st enia soli kuchennej

(NaCl) na temperatur denaturacji oksyhemoglobiny i methemoglobiny odpowiednio

w roztworach o pH = 5,6 i pH = 6,8. Wyniki analizy statystycznej ocenianych

zmiennych (forma barwnika, pH roztworu, dodatek soli) na temperatur denaturacji

analizowanych barwników krwi przedstawiono w tab. 1.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: