METODY IDENTYFIKACJI GENETYCZNIE ZMODYFIKOWANYCH.pdf
(
312 KB
)
Pobierz
Microsoft Word - 005_016_Dulinski
ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2007, 4 (53), 5 – 16
ROBERT DULIŃSKI
METODY IDENTYFIKACJI GENETYCZNIE ZMODYFIKOWANYCH
ORGANIZMÓW W ŻYWNOŚCI
S t r e s z c z e n i e
W pracy przedstawiono najważniejsze metody analityczne stosowane w detekcji genetycznie zmody-
fikowanej żywności. Zdecydowana większość technik polega na identyfikacji zmian w strukturze dwóch
biologicznie czynnych makrocząsteczek: DNA oraz białek. W przypadku kwasów nukleinowych podsta-
wowe narzędzie diagnostyczne stanowi reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), pozwalająca na selektyw-
ną amplifikację wybranych regionów DNA wraz z jakościową i ilościową oceną wprowadzonych modyfi-
kacji. Reakcja PCR w czasie rzeczywistym jest obecnie uznawana za wiodącą metodę analizy zawartości
genetycznie zmodyfikowanych organizmów w roślinach uprawnych i produktach żywnościowych. Na
określenie modyfikacji genetycznych manifestujących się na poziomie struktury białek pozwalają testy
immunoenzymatyczne polegające na selektywnym rozpoznaniu rekombinantowego białka przez specjal-
nie zaprojektowane przeciwciało. Jednak zarówno uproszczony wariant identyfikacji kompleksu antygen –
przeciwciało na nitrocelulozowym pasku, jak i klasyczna wersja testu immunochemicznego na mikropłyt-
ce traktowane są przede wszystkim jako metody oceny jakościowej.
Wraz z rozwojem technologii manipulacji genowych, rosnącą liczbą transformacji roślin i prawdopo-
dobnie w niedalekiej przyszłości zwierząt, obserwowana jest tendencja do opracowania wiarygodnych
testów, pozwalających na detekcję oraz analizę ilościową kilku genetycznych modyfikacji w trakcie poje-
dynczego oznaczenia.
Słowa kluczowe:
genetycznie zmodyfikowane organizmy, reakcja łańcuchowa polimerazy, testy
immunoenzymatyczne
Wprowadzenie
Od połowy lat 90. XX w., czyli od momentu wprowadzenia na rynek przez firmę
Calgene pierwszego produktu żywnościowego będącego rezultatem genetycznej mody-
fikacji – pomidora Flavr Savr™ – obserwuje się rosnące zainteresowanie technologią
DNA żywności. Inżynieria genetyczna jest implementowana do rolnictwa, przemysłu
spożywczego i paszowego celem poprawienia użytkowych cech roślin uprawnych
Dr R. Duliński, Katedra Biotechnologii Żywności, Wydz. Technologii Żywności, Akademia Rolnicza im.
Hugona Kołłątaja, ul. Balicka 122, 30-149 Kraków
6
Robert Duliński
(tolerancja na herbicydy, odporność na choroby i szkodniki), poprawienia technolo-
gicznych właściwości w trakcie przechowywania i obróbki (twardość owoców) czy też
ulepszenia sensorycznych i funkcjonalnych cech produktów żywnościowych (jakość
skrobi, zawartość witamin i aminokwasów) (tab. 1) [1, 2, 3, 7].
T a b e l a 1
Przykłady modyfikacji stosowanych w uprawach roślin oraz produkcji GM żywności.
Examples of modifications applied to transgenic crops and production of GM food.
Opis modyfikacji
Modification description
Korzyści dla rolnika lub
konsumenta
Benefits for farmer or
consumer
Przykłady roślin uprawnych
i produktów żywnościowych
Examples of transgenic
crops and food
Wprowadzenie genu podwyższającego
próg tolerancji na środki chwastobój-
cze np. glifosat
Introduction of a gene increasing toler-
ance level for herbicides i.e. glyphosate
zwiększona odporność na
herbicydy
increased herbicide
tolerance
soja Roundup
®
Ready,
Roundup
®
Ready soy
Wprowadzenie genu
cry
pochodzącego
z
Bacillus thuringiensis
kodującego
bakteryjną endotoksynę perforującą
układ trawienny owada
Introduction of the
cry
gene from
Bacillus thuringiensis
encoding bac-
terial endotoxin degrading insect diges-
tive system
ochrona przed szkodnikami
protection against insects
pests
ziemniaki NewLeaf™,
kukurydza Bt176, Bt11
NewLeaf™ potato,
Bt176, Bt11 corn
Wprowadzenie genów kodujących
enzymy odpowiedzialne za wczesne
etapy biosyntezy
β
-karotenu, pocho-
dzących z żonkila i bakterii
Erwinia
uredovora
Introduction of genes encoding en-
zymes for early stages of
β
-carotene
biosynthesis derived from daffodil and
bacteria
Erwinia uredovora
wzrost zawartości
prowitaminy A
increased provitamin A
content
„Złoty ryż”
Golden Rice
Ograniczenie biosyntezy enzymu
poligalaktouronazy odpowiedzialnego
za mięknięcie owoców
Decreased polygalactouronase biosyn-
thesis, the enzyme responsible for fruit
ripening
wydłużenie okresu prze-
chowywania i przydatności
do spożycia
elongated shelf-life and
consumption period
pomidory Flavr Savr™
Flavr Savr™ tomato
Źródło: opracowanie własne na podstawie [1, 3, 7, 24] / Source: according to the published data [1, 3, 7,
24].
Niezależnie od obaw, jakie wzbudzają rozwiązania polegające na rekombinacji
DNA, wydaje się, że zarówno z perspektywy zwolenników, jak i przeciwników gene-
tycznie zmodyfikowanych organizmów (GMO) istotnym problemem jest ustalenie
METODY IDENTYFIKACJI GENETYCZNIE ZMODYFIKOWANYCH ORGANIZMÓW W ŻYWNOŚCI
7
wiarygodnych i powszechnie akceptowanych metod identyfikacji GMO. Prawo kon-
sumenta do wyboru pomiędzy naturalnym produktem a efektem manipulacji genetycz-
nej jest realizowane przez odpowiedni system znakowania żywności, zaś zgodnie
z rozporządzeniem UE nr 1829/2003 maksymalna zawartość GMO w nieoznakowa-
nych produktach nie może przekraczać 0,9% [27, 29].
W 1999 r. Unia Europejska w ramach Wspólnego Centrum Badawczego (JRC
,
ang. Joint Research Centre) zainicjowała tworzenie sieci wyspecjalizowanych labora-
toriów analizujących GMO (ENGL, ang. European Network of GMO Laboratories).
Do projektu przystąpiły również polskie jednostki badawcze m.in. Instytut Hodowli
i Aklimatyzacji Roślin w Radzionkowie, Państwowy Instytut Weterynaryjny w Puła-
wach czy inspekcje podległe Głównemu Inspektoratowi Sanitarnemu (Białystok, Tar-
nobrzeg i in.). Celem tych placówek jest współpraca i wymiana poglądów, opracowa-
nie i walidacja skutecznych metod jakościowej i ilościowej oceny żywności genetycz-
nie zmodyfikowanej [14].
Metody detekcji GMO w żywności
Białka i kwasy nukleinowe to dwa typy makromolekuł specyficznych dla gene-
tycznych modyfikacji, których analiza może potwierdzić obecność GMO w żywności.
Modyfikacja jest inicjowana na poziomie DNA i polega na wprowadzeniu do istnieją-
cego zestawu genów nowej sekwencji zapewniającej np. odporność rośliny na herbicy-
dy. Ta zmiana w sensie fenotypowym objawia się poprzez biosyntezę nowego białka
zakodowanego we wprowadzonej sekwencji DNA.
W przypadku białek zasadniczą techniką stosowaną do identyfikacji jest test im-
munoenzymatyczny ELISA (ang. enzyme linked immunosorbent assay). Zmiany na
poziomie sekwencji DNA monitorowane są poprzez reakcję łańcuchową polimerazy
PCR (ang. polymerase chain reaction), powszechnie stosowaną technikę biologii mo-
lekularnej, pozwalającą na detekcję określonych fragmentów DNA wprowadzonych do
genomu badanej rośliny. Spotykane są również połączenia obu metod tzw. PCR-
ELISA i należy je traktować bardziej jako komplementarne niż wykluczające się anali-
zy [20].
Testy immunoenzymatyczne
Zestawy analityczne bazują na wykorzystaniu przeciwciał selektywnych wobec
określonego – w tym przypadku genetycznie zmodyfikowanego (GM) białka – i nastę-
pującej po rozpoznaniu antygenu reakcji barwnej. Tego rodzaju oznaczenia są po-
wszechnie stosowane i akceptowane w wielu aplikacjach dotyczących kontroli obecno-
ści witamin, antybiotyków, patogenów czy też substancji specyficznych w produktach
żywnościowych [4, 17]. W celu opracowania testu ELISA na GMO należy wyizolować
rekombinantowe białko z żywności czy też rośliny uprawnej, a następnie wyproduko-
8
Robert Duliński
wać przeciwciała specyficzne wobec tej proteiny. Przeciwciała są najczęściej unieru-
chamiane na mikropłytce i oznakowane substancją, która w trakcie analizy utworzy
barwny produkt. Istnieją dwa typy testów immunochemicznych polegających na reak-
cji antygen
–
przeciwciało wykorzystywanych w detekcji GMO.
Testy paskowe
Przeciwciała skierowane wobec GM białka zostają immobilizowane na pasku ni-
trocelulozowym. Po zanurzeniu testera w probówce zawierającej ekstrakt roślinnej
tkanki z transgenicznym białkiem następuje utworzenie kompleksu z częścią przeciw-
ciał znakowanych barwnym reagentem. Kompleks białkowy dzięki porowatej mem-
branie wędruje do jednego z przeciwległych końców paska, który ma dwie strefy. Jed-
na z nich jest specyficzna dla kompleksu przeciwciało
–
rekombinantowe białko, a dru-
ga dla niezwiązanych przeciwciał znakowanych tylko barwnikiem. O pozytywnym
wyniku próby decyduje obecność dwóch barwnych linii: kontrolnej – świadczącej
o prawidłowym wykonaniu oznaczenia oraz testowej – potwierdzającej obecność
GMO. Powszechnie stosowane są testy na obecność bakteryjnej endotoksyny z
Bacil-
lus thuringensis
oraz białka sojowego CP4 EPSPS [2].
Testy mikropłytkowe
Oznaczenie odbywa się na mikropłytce titracyjnej z usuwalnymi 8-12 studzien-
kowymi paskami, na której unieruchomione są przeciwciała skierowane wobec GM
białka. W zasadniczej wersji kompleks przeciwciało – antygen może być wizualizowa-
ny przez użycie drugiego przeciwciała skoniugowanego z enzymem przeprowadzają-
cym reakcję chromogenną. Procedura obejmuje często kilka etapów „opłaszczania”
oraz przemywania substancji immobilizowanych na dnie studzienek. Ostatecznym
potwierdzeniem obecności GMO jest reakcja barwna, której intensywność – w przy-
padku dysponowania standardami o znanej zawartości GMO – jest podstawą do ilo-
ściowego oznaczenia białka. Przykładowy limit detekcji białka sojowego CP4 EPSPS
wynosi 0,25% w przypadku nasion i 1,45% - produktów mięsnych [18].
Metody immunoenzymatyczne mają jednak pewne wady, które nakazują trakto-
wać je raczej jako techniki jakościowe. W przypadku produktów żywnościowych pod-
legających skomplikowanej obróbce technologicznej można oczekiwać przynajmniej
częściowej denaturacji białka, co może skutkować utratą powinowactwa przeciwciała
wobec oznaczanej proteiny. Konsekwencją selektywności reakcji ELISA jest ograni-
czenie stosowania określonego zestawu tylko i wyłącznie do jednego typu zmodyfiko-
wanego białka, ponadto wątpliwości budzi trudny do oszacowania wpływ odmiany
rośliny, fazy wzrostu, rodzaju tkanki i warunków polowych na wynik oznaczenia [1].
Jednak w przypadku analizy DNA również nie można wykluczyć fragmentacji doce-
lowego materiału wskutek termicznej obróbki produktów, ponadto wydajność izolacji
METODY IDENTYFIKACJI GENETYCZNIE ZMODYFIKOWANYCH ORGANIZMÓW W ŻYWNOŚCI
9
kwasów nukleinowych z takich wysoko przetworzonych próbek, jak np. olej rafinowa-
ny, nie zawsze pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości matrycy [5].
Techniki PCR
Rozwinięta, w drugiej połowie lat 80. XX w., reakcja łańcuchowej syntezy frag-
mentów DNA umożliwia selektywną amplifikację wybranych regionów DNA i stała
się w przypadku detekcji GMO zasadniczą techniką diagnostyczną [9, 16, 18, 19, 22].
Materiałem docelowym jest w tym przypadku kwas deoksyrybonukleinowy, który
należy wyizolować przy użyciu określonej procedury uzależnionej od charakteru prób-
ki. Zalecane są protokoły z zastosowaniem detergentu jonowego bromku heksadecylo-
trimetyloamoniowego (CTAB) lub też gotowych komercyjnych zestawów do izolacji
polegających często na selektywnym związaniu, a następnie elucji kwasu nukleinowe-
go na minikolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym [23]. Wydajność izolacji
uzależniona jest od stopnia przetworzenia żywności, zdecydowanie większą efektyw-
ność uzyskuje się w przypadku oczyszczania DNA z wyjściowych roślin uprawnych
[5]. Po uzyskaniu czystej frakcji DNA, gotowej do amplifikacji, pozostaje wybór po-
między dwoma zasadniczymi systemami PCR.
Konwencjonalny PCR
Ten wariant techniki PCR stosowany jest do analizy jakościowej oraz półilościo-
wej, wskazując głównie na obecność bądź nieobecność poszukiwanych sekwencji w
próbce. Finalny etap identyfikacji produktów stanowi rozdział elektroforetyczny na żelu
agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Równocześnie z produktami PCR rozdziela-
ne są markery mas molekularnych w celu precyzyjnego określenia wielkości amplikonu.
Podstawowy element testu skriningowego oprócz standardowych składników:
oligonukleotydów, polimerazy
Taq
i matrycy DNA stanowią startery komplementarne
do sekwencji DNA najczęściej wykorzystywanych w modyfikacjach genetycznych
roślin (tab. 2). Powszechnie używanym promotorem do regulacji ekspresji transgenu
jest promotor 35S pochodzący z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i terminator genu
nopalinowej syntazy (nos) występujący naturalnie w bakteriach glebowych
Agrobacte-
rium tumefaciens
[21].
Zidentyfikowanie takiej sekwencji w finalnym produkcie PCR świadczy o zanie-
czyszczeniu GMO, ale nie jest to dowód ostateczny, bowiem nie daje odpowiedzi na
temat charakteru wprowadzonej zmiany. Potwierdzenie może nastąpić poprzez (1)
zastosowanie specyficznego trawienia enzymami restrykcyjnymi, (2) hybrydyzację
z sondą DNA komplementarną wobec docelowej sekwencji lub (3) bezpośrednie
zsekwencjonowanie finalnego produktu co jest zabiegiem dosyć kosztownym.
Plik z chomika:
katasza1982
Inne pliki z tego folderu:
barwniki.pdf
(1916 KB)
Najczęstsze błędy żywieniowe(1).ppt
(2739 KB)
Najczęstsze błędy żywieniowe.ppt
(2739 KB)
GMP w wytwórniach kosmetyków.pdf
(182 KB)
Procesy utleniania węglowodorów alkiloaromatycznych w fazie ciekłej.ppt
(4649 KB)
Inne foldery tego chomika:
Gilian McKeith - Jestes tym co jesz
Weganizm, wegetarianizm
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin