Ocena zawartości mikotoksyn w zbożach paszowych i paszach metodą immunoenzymatyczną.pdf

N auka P rzyroda T echnologie

2009

Tom 3

Zeszyt 4

ISSN 1897-7820 http://www.npt.up-poznan.net

Dział: Nauki o Żywności i Żywieniu

R ENATA C EGIELSKA -R ADZIEJEWSKA , T OMASZ S ZABLEWSKI , K AROLINA K AROLCZAK ,

A NNA K ACZMAREK , J ACEK K IJOWSKI

Katedra Zarządzania Jakością Żywności

Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

OCENA ZAWARTOŚCI MIKOTOKSYN

W ZBOŻACH PASZOWYCH I PASZACH

METODĄ IMMUNOENZYMATYCZNĄ

Streszczenie. Mikotoksyny są toksycznymi metabolitami wtórnymi grzybów (pleśni), należącymi

przede wszystkim do rodzaju Aspergillus , Penicillium i Fusarium . Ich obecność w zbożach

i paszach prowadzi do strat w produkcji zwierzęcej. Obowiązująca obecnie norma PN-EN ISO

22000:2006 wskazując konieczność zapewnienia bezpieczeństwa żywności na wszystkich eta-

pach produkcji i obrotu „od pola do stołu”, wymaga kontroli i wycofania zbóż i pasz skażonych

mikotoksynami, dlatego też priorytetowe jest wykorzystanie szybkich i efektywnych metod kon-

troli mikotoksyn mających zastosowanie w całym łańcuchu produkcji żywności. Celem pracy

była ocena obecności deoksyniwalenolu i zearalenonu w zbożach i paszach z wykorzystaniem

testów ELISA. Badania wskazują na znaczenie mikotoksyn jako potencjalnego zagrożenia w pro-

dukcji pasz i konieczność systemowego podejścia w celu zapewnienia ich bezpieczeństwa. Spo-

śród badanych zbóż i pasz największe stężenie deoksyniwalenolu stwierdzono w przypadku

kukurydzy i pasz produkowanych na jej bazie. Podobne rezultaty uzyskano, testując zboża i pasze

na zawartość zearalenonu. Stwierdzono, że metodę immunoenzymatyczną ELISA można zasto-

sować do oznaczania mikotoksyn w paszach i zbożach. Zestawy testów są praktyczne i łatwe

w obsłudze.

Słowa kluczowe: mikotoksyny, deoksyniwalenol, zearalenon, zboża

Wstęp

Mikotoksyny są toksycznymi metabolitami wtórnymi grzybów (pleśni), należącymi

przede wszystkim do rodzajów Aspergillus, Penicillium i Fusarium. Pod względem

chemicznym mikotoksyny zalicza się do węglowodorów aromatycznych (rzadko alifa-

tycznych) o małej masie cząsteczkowej, co decyduje o ich znacznej oporności na czyn-

niki środowiskowe oraz o braku właściwości immunogennych lub słabych właściwo-

Cegielska-Radziejewska R., Szablewski T., Karolczak K., Kaczmarek A., Kijowski J., 2009. Ocena zawartości miko-

toksyn w zbożach paszowych i paszach metodą immunoenzymatyczną. Nauka Przyr. Technol. 3, 4, #114.

ściach. Mikotoksyny, obok działania toksycznego, wykazują również właściwości rako-

twórcze, mutagenne, teratogenne i estrogenne, a ich szkodliwe działanie stwierdza się

nawet w przypadku występowania w niewielkich stężeniach (H USSEIN i B RASEL 2001,

K OŁACZYŃSKA -J ANICKA 2006).

Na porażonych zbiorach zbóż rozwijają się grzyby z rodzaju Fusarium. Ich wtórne

metabolity to trichoteceny, a przede wszystkim deoksyniwalenol i występujący

w mniejszych ilościach niwalenol. Mikotoksyny te porażają kłosy i wiechy zbóż we

wszystkich strefach klimatycznych. Deoksyniwalenol, z uwagi na powszechne wystę-

powanie i silną toksyczność, jest uważany za jedną z groźniejszych mikotoksyn zanie-

czyszczających produkty pochodzenia zbożowego przeznaczone na cele spożywcze

i paszowe (P ITTET 1998). Obecność i zawartość mikotoksyn w ziarnie zbóż i paszach

stanowi ważny wskaźnik ich jakości. Ocenia się, że mikotoksyny corocznie powodują

zniszczenie lub pogorszenie jakości około 20-25% zbóż, a w konsekwencji straty

w hodowli zwierząt. Spożycie toksyn powoduje mikotoksykozy – choroby cechujące się

specyficznymi efektami u zwierząt gospodarskich, takimi jak: uszkodzenia i nowotwory

wątroby w przypadku aflatoksyn, uszkodzenia nerek w przypadku ochratoksyny A,

zaburzenia płodności trzody spowodowane przez zearalenon, utrata łaknienia i wymioty

u trzody wywołane spożyciem z paszą deoksyniwalenolu. Ostre postacie zatruć wystę-

pują w hodowli stosunkowo rzadko i ważniejszym problemem są stany długotrwałych

mikotoksykoz, objawiające się spadkiem przyrostów, zmniejszeniem współczynnika

wykorzystania paszy bądź zwiększoną liczbą brakowanych zwierząt.

Zanieczyszczenie mikotoksynami żywności i pasz w znacznym stopniu zależy od

warunków środowiska, które mogą umożliwiać powstawanie i wzrost pleśni. Skażenie

może nastąpić na każdym etapie produkcji (rozwój roślin, zbiór, obróbka, przechowy-

wanie i transport). W zbożu wysuszonym po zbiorze, przy wilgotności powyżej 13%,

grzyby toksynotwórcze znajdują dobre warunki do rozwoju (C HEŁKOWSKI 1997, 2004,

S CHRÖDTER 2004, G LENN 2007, J OUANY 2007).

Ze względu na znaczną odporność mikotoksyn odkażanie silnie zanieczyszczonych

plonów jest zadaniem bardzo trudnym. Skutecznym rozwiązaniem jest identyfikacja

skażonych produktów i wycofanie ich z łańcucha pokarmowego. Priorytetowe jest

opracowanie i wykorzystanie efektywnych metod kontroli, mających zastosowanie

w całym łańcuchu produkcji żywności (Q UILLIEN 2002, S AEGER i IN . 2006).

Celem pracy była ocena zawartości deoksyniwalenolu i zearalenonu w zbożach pa-

szowych i paszach z wykorzystaniem testów ELISA oraz określenie możliwości zasto-

sowania metody immunoenzymatycznej do monitorowania zawartości mikotoksyn

w przemyśle paszowym.

Materiał i metody

Do oznaczenia zawartości deoksyniwalenolu i zearalenonu w paszach i zbożach pa-

szowych zastosowano metodę immunoenzymatyczną ELISA, z wykorzystaniem testu

Veratox firmy Neogen. Odczyt gęstości optycznej prób wykonano, stosując czytnik

mikropłytkowy firmy Neogen przy długości fali 650 nm. Zgodnie z zaleceniem wyniki

odczytano w ciągu 20 min od momentu dodania roztworu Red Stop. Gęstość optyczna

wzorców tworzy krzywą standardową (zależność absorbancji od stężenia mikotoksyny),

Cegielska-Radziejewska R., Szablewski T., Karolczak K., Kaczmarek A., Kijowski J., 2009. Ocena zawartości miko-

toksyn w zbożach paszowych i paszach metodą immunoenzymatyczną. Nauka Przyr. Technol. 3, 4, #114.

z którą porównywano wyniki prób badanych i na tej podstawie obliczano właściwe

stężenie badanej mikotoksyny. Dla każdej przeprowadzonej analizy, oprócz wyników

absorbancji i stężenia, uzyskano obliczoną wartość współczynnika korelacji R (zależ-

ność absorbancji od stężenia A/c). Zgodnie z zaleceniem producenta wyniki uznaje się

za wiarygodne, gdy wartość współczynnika R nie jest mniejsza niż 0,996.

Analizie poddano próby zbóż paszowych i pasz (po 24) pobrane losowo, w różnych

odstępach czasowych, z czterech wytwórni pasz (A-D). W badaniach testowano zboża

do produkcji pasz, takie jak: kukurydza, pszenica, jęczmień, żyto, pszenżyto. Zawartość

mikotoksyn oznaczono również w paszach o zróżnicowanym składzie. Poniżej podano

podstawowe składniki testowanych pasz i ich oznaczenia: pasza 1: pszenica 25%, śruta

sojowa 20%, jęczmień 25%, pasza 2: pszenica 50%, kukurydza 25%, jęczmień 10%,

pasza 3: pszenica 50%, jęczmień 18%, śruta sojowa 14%, pasza 4: pszenica 46%, kuku-

rydza 44%. Zawartość deoksyniwalenolu oznaczono w paszach 3 i 4, natomiast zearale-

nonu – we wszystkich wymienionych rodzajach pasz.

Próby do badań pobrano próbnikiem zgodnie z techniką pobierania prób. Próbę re-

prezentatywną całkowicie rozdrobniono i do momentu ekstrakcji przechowywano

w temperaturze 2-8°C. Do ekstrakcji próby użyto 70-procentowego roztworu meta-

nol/woda. Po dodaniu rozpuszczalnika próbę intensywnie wytrząsano przez 3 min.

Ekstrakt przefiltrowano przez przepuszczenie przynajmniej 5 ml przez filtr Whatman 1

i zebrano filtrat jako próbę. Próbę do badań przygotowano do oznaczenia poprzez roz-

cieńczenie ekstraktu wodą w stosunku 1:5. Przed rozpoczęciem analizy, testy (wszyst-

kie reagenty) doprowadzono do temperatury pokojowej, około 18-30°C.

Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Wykonano podstawowe obliczenia

dla każdej zmiennej, oznaczając wartość średnią, odchylenie standardowe, błąd standar-

dowy i przedział ufności. W celu określenia istotności wpływu rodzaju pasz i zbóż na

zawartość mikotoksyn przeprowadzono analizę wariancji. Ze względu na niejednorod-

ność wariancji zastosowano test nieparametryczny Anova rang Kruskala-Wallisa. Za

statystycznie istotne uznano zależności na poziomie istotności α nie przekraczającym

0,05. Obliczenia statystyczne wykonano, stosując oprogramowanie Statistica PL v. 8.0.

Wyniki i dyskusja

Obecne przepisy unijne dopuszczają stężenie deoksyniwalenolu w nieprzetworzo-

nych ziarnach kukurydzy, pszenicy i owsa na poziomie 1750 µg/kg, natomiast w pozo-

stałych zbożach zalecany poziom to 1250 µg/kg. W krajach Unii Europejskiej zaleca

się, żeby zawartość deoksyniwalenolu w paszy pełnoporcjowej i uzupełniającej dla świń

nie przekraczała 900 µg/kg (R OZPORZĄDZENIE ... 2007, Z ALECENIE ... 2006).

Przeprowadzona analiza wariancji Anova rang Kruskala-Wallisa wykazała istotny sta-

tystycznie wpływ rodzaju zboża na zawartość deoksyniwalenolu. Średnia zawartość ozna-

czanej mikotoksyny była największa w próbach kukurydzy i kształtowała się na poziomie

1200 µg/kg, podczas gdy w próbach jęczmienia i żyta nie przekraczała 300 µg/kg (rys. 1).

Największe stężenie deoksyniwalenolu, przekraczające zalecany poziom 1750 µg/kg,

uzyskano w przypadku kukurydzy pochodzącej z wytwórni B. W dwóch spośród czte-

rech badanych prób kukurydzy z wytwórni A stężenie przekraczało 1500 µg/kg.

Stwierdzono, że również w innych badanych próbach kukurydzy stężenie mikotoksyny

Cegielska-Radziejewska R., Szablewski T., Karolczak K., Kaczmarek A., Kijowski J., 2009. Ocena zawartości miko-

toksyn w zbożach paszowych i paszach metodą immunoenzymatyczną. Nauka Przyr. Technol. 3, 4, #114.

1 600

1 400

1 200

1 000

800

600

400

200

–200

–400

Kukurydza

Pszenica

Jęczmień Żyto

Rys. 1. Zawartość deoksyniwalenolu w różnych rodzajach zbóż

Fig. 1. Deoxynivalenol content in different cereals

było znacznie większe aniżeli w próbach pozostałych zbóż. Spośród badanych prób

pszenicy największą zawartość deoksyniwalenolu oznaczono w próbach pochodzących

z wytwórni A (100-400 µg/kg). W pozostałych stężenie mikotoksyny nie przekraczało

200 µg/kg.

Oznaczona zawartość mikotoksyny w próbach pasz była zróżnicowana i kształtowa-

ła się na poziomie 300-2150 µg/kg. Nie wykazano istotnego statystycznie wpływu ro-

dzaju paszy na średnią zawartość deoksyniwalenolu. Można jednak stwierdzić, że więk-

sze stężenie mikotoksyny uzyskano w paszy 4. Oznaczone stężenie deoksyniwalenolu

w trzech próbach paszy przekraczało zalecany poziom ponad dwukrotnie (rys. 2). Pró-

by, w których stężenie mikotoksyny znalazło się ponad przyjętym dopuszczalnym po-

ziomem, pochodziły z tej samej wytwórni. Podstawowymi składnikami wymienionej

paszy były pszenica (46%) i kukurydza (44%). W próbach paszy 3, zawierającej rów-

nież jęczmień i mączkę rybną, zawartość deoksyniwalenolu była mniejsza i nie przekra-

czała 650 µg/kg.

Oznaczone w badanych próbach zbóż stężenie zearalenonu było znacznie mniejsze niż

zawartość deoksyniwalenolu. W żadnej z prób nie stwierdzono przekroczenia przyjętego

dopuszczalnego stężenia mikotoksyny. Na podstawie przepisów Unii Europejskiej do-

puszczalne stężenie mikotoksyny w nieprzetworzonych zbożach ustalono na poziomie

100 µg/kg, natomiast w nieprzetworzonej kukurydzy – 350 µg/kg. W przypadku pasz

przeznaczonych dla prosiąt maksymalna zawartość mikotoksyny może wynosić 100

µg/kg. Podobnie jak w przypadku deoksyniwalenolu, największe stężenie zearalenonu

stwierdzono w próbach kukurydzy. Średnia zawartość mikotoksyny we wszystkich

badanych próbach była znacznie większa niż w próbach pozostałych zbóż i wynosiła

98,61 µg/kg. W przypadku żyta, jęczmienia, pszenicy i pszenżyta kształtowała się na

zbliżonym poziomie – około 25 µg/kg (rys. 3). Ze względu na niejednorodność warian-

cji zastosowano test nieparametryczny Anova rang Kruskala-Wallisa i wykazano brak

Cegielska-Radziejewska R., Szablewski T., Karolczak K., Kaczmarek A., Kijowski J., 2009. Ocena zawartości miko-

toksyn w zbożach paszowych i paszach metodą immunoenzymatyczną. Nauka Przyr. Technol. 3, 4, #114.

2 200

2 000

1 800

1 600

1 400

1 200

1 000

800

600

400

200

–200

–400

–600

–800

Pasza 3

Pasza 4

Średnia

Średnia±Odch.std

Średnia±1,96*Odch.std

Rys. 2. Wpływ rodzaju paszy na zawartość deoksyniwalenolu

Fig. 2. The effect of type of feed on deoxynivalenol concentration

160

140

120

100

–20

–40

–60

Kukurydza Żyto

Jęczmień Pszenica Pszenżyto

Rys. 3. Zawartość zearalenonu w różnych rodzajach zbóż

Fig. 3. Zearalenone content in different cereals

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: