enzymy.pdf

4. Wprowadzenie do enzymologii

4.1. Koncepcja biokatalizy

W ˝ywym organizmie zachodzà tysiàce ró˝nych reakcji chemicznych. Wi´kszoÊç z nich wy-

maga dostarczenia z zewnàtrz energii, w przeciwnym razie nawet si´ nie rozpocznà (mówimy,

˝e nie zostanà zainicjowane). W temperaturach, w których mo˝e funkcjonowaç ˝ywy orga-

nizm, tempo tych reakcji jest tak ma∏e, ˝e a˝ niezauwa˝alne. Wynika to z tego, ˝e energia we-

wn´trzna uk∏adu, który ma reagowaç, jest zbyt niska. Dlatego atomy i (lub) czàsteczki

zderzajà si´ ze sobà zbyt rzadko i niezbyt mocno. Nie wystarcza to do pokonania bariery pro-

gu energetycznego reakcji . Mo˝na powiedzieç (w ogromnym uproszczeniu), ˝e substraty sà

zbyt leniwe i powolne, aby reagowaç.

Tak wi´c, aby znaczàco przyspieszyç pr´dkoÊç reakcji, mo˝na:

1. Dostarczyç energii do uk∏adu przez podniesienie

temperatury – niewàtpliwie osiàgniemy sukces, bo-

wiem szybkoÊç reakcji zwi´kszy si´ w miar´ wzrostu

temperatury. B´dzie to jednak pyrrusowe zwyci´-

stwo – coÊ w rodzaju: „operacja si´ uda∏a, tylko pa-

cjent zmar∏”. Wynika to z tego, ˝e bia∏ka ustrojowe

denaturujà ju˝ w temperaturze ok. 45°C (por.

ROZDZ. 2.2). Tymczasem organizm zginie, zanim

osiàgnie po˝àdane tempo metabolizmu (por. te˝ ryc. 16). Nale˝y tutaj dodaç, ˝e energia

cieplna zaliczana jest do form nisko u˝ytecznych biologicznie – trudno jà magazynowaç,

przerabiaç i przesy∏aç. Ciep∏o jest wi´c z∏em koniecznym, a jego dostarczanie musi byç roz-

sàdnie ograniczane (por. PODR. KL. II).

2. Dostarczyç innej formy energii , na przyk∏ad Êwietl-

nej, o wysokiej u˝ytecznoÊci biologicznej. Niestety,

iloÊç Êwiat∏a, jaka by∏aby tu niezb´dna, to luksus

rzadko spotykany na naszej planecie (pomijam ju˝

problem, co np. robiç nocà?).

3. Zrezygnowaç z „pomys∏u” dostarczania du˝ych por-

cji energii i zadowoliç si´ ma∏ymi . W ten sposób po-

zostaniemy w zakresie temperatur dozwolonych

– tolerowalnych przez organizm. Rozwiàzania wymaga jedynie drobiazg – mniej wi´cej mi-

lion razy za wolne tempo reakcji biochemicznych w stosunku do potrzeb. Za∏amywaç ràk

nie trzeba, nale˝y obejÊç to ograniczenie przez zastosowanie enzymów (dawniej fermen-

tów). Nazwa tych zwiàzków pochodzi z greckiego enzyme , co oznacza czynnik obecny

w dro˝d˝ach, i zosta∏a wprowadzona przez Niemca Kuhnego, który bada∏ fermentacj´ al-

koholowà.

Enzymy sà katalizatorami , gdy˝ majà w∏aÊciwoÊç zwi´kszania szybkoÊci reakcji chemicz-

nych , same jednak nie ulegajà przemianom . Mówimy wi´c, ˝e enzymy nie zu˝ywajà si´

w przeprowadzanych przez siebie reakcjach (por. jednak ni˝ej).

MOLEKULARNE POD¸O˚E BIOLOGII

Ryc. 16.

Ogólne zasady energetyczne reakcji niekatali-

zowanych i katalizowanych ustroju

(Ea 1 – energia aktywacji dla reakcji niekatali-

zowanej, Ea 2 – energia aktywacji dla reakcji

przyspieszanej przez enzym,

Uwaga: Oprócz enzymów do biokatalizatorów zalicza si´ (skàdinàd nies∏usznie) hormony

i witaminy! W tej ksià˝ce poj´cie biokatalizatora b´dzie si´ jednak odnosi∏o tylko do

enzymów (w przeciwnym razie zostanie to wyraênie zaznaczone).

4.2. Budowa i dzia∏anie enzymów

WSZYSTKIE POZNANE DOTYCHCZAS ENZYMY SÑ BIA¸KAMI

Od czasu odkrycia i wyodr´bnienia w postaci krystalicznej pierwszego enzymu – ureazy

(dokona∏ tego Sumner w 1926 r.) wyizolowano, oczyszczono i zanalizowano setki ró˝nych bio-

katalizatorów. Zdecydowana wi´kszoÊç z nich nale˝y do bia∏ek z∏o˝onych . Jedynie cz´Êç hy-

drolaz i nieliczne izomerazy sà bia∏kami prostymi (por. ni˝ej). W zasadzie wi´c ca∏a

czàsteczka biokatalizatora, tak zwany holoenzym (gr. holo oznacza ca∏y), sk∏ada si´ z:

a) cz´Êci bia∏kowej – apoenzymu ;

b) cz´Êci niebia∏kowej – grupy prostetycznej , przy∏àczonej do apoenzymu. JeÊli cz´Êç

niebia∏kowa po∏àczona jest nietrwale z apoenzymem, wówczas mówi si´ o koenzy-

mie . W celu unikni´cia zamieszania proponuj´ u˝ywaç nazwy kofaktor dla cz´Êci nie-

bia∏kowej (jest to jednak zabieg nieformalny!).

Nale˝y zadaç sobie trud znalezienia odpowiedzi na pytanie: dlaczego do przeprowadze-

nia reakcji enzym potrzebuje tylko niewielkiej porcji energii?

Ca∏e rozwiàzanie polega na tworzeniu przez enzym (E) przejÊciowego po∏àczenia z sub-

stratem (S) albo z substratami (zale˝y to od enzymu i rodzaju reakcji – znajdê kilka przyk∏a-

dów!). To po∏àczenie nazywa si´ kompleksem enzym-substrat (E-S). Ogólne równanie

reakcji katalizowanej przez enzym mo˝na zapisaç nast´pujàco:

W momencie wytworzenia kompleksu E-S w samym substracie dochodzi do przesuwania

okreÊlonych elektronów. Skutkiem jest powstawanie nowych wiàzaƒ lub rozrywanie ju˝ ist-

niejàcych. ÂciÊle mówiàc, obecnoÊç enzymu daje nast´pujàce korzyÊci:

1. Zwi´ksza si´ prawdopodobieƒstwo zderzeƒ pomi´dzy reagujàcymi czàsteczkami. To tak,

jak gdyby ktoÊ zbli˝y∏ do siebie zagubione osoby – bez tej interwencji szansa na spotkanie

by∏aby niewielka.

G – zmiana

energii swobodnej reakcji). Zwróç uwag´ na

poziom energetyczny substratu i produktu.

∆

4. Wprowadzenie do enzymologii

2. Substraty zostajà prawid∏owo zorientowane w przestrzeni trójwymiarowej – czàsteczki

w roztworze bez enzymu zderzajà si´ bez∏adnie, najcz´Êciej nie tymi „cz´Êciami” co trzeba.

Biokatalizator spe∏nia wi´c funkcj´ kogoÊ, kto ustawia je wzgl´dem siebie tak, ˝e reagujà-

ce wiàzania znajdà si´ w bezpoÊrednim sàsiedztwie.

3. Dochodzi do napr´˝ania wiàzaƒ w substracie – w momencie wpasowywania substratu do

enzymu (tworzenia kompleksu E-S) nast´puje nadwer´˝anie wiàzaƒ w samym substracie.

Takie naruszone wiàzanie doÊç ∏atwo mo˝na teraz zmieniç (por. tak˝e ni˝ej).

Nie oznacza to jednak, ˝e enzym mo˝e zrobiç z reakcjà, co chce. Przede wszystkim jego

obecnoÊç nie przesuwa stanu równowagi katalizowanej przemiany. Wyobraê sobie odwracal-

nà reakcj´, w której równowaga ustala si´ na nast´pujàcym poziomie: substratu jest 200 razy

wi´cej ni˝ produktu. I nie jest wa˝ne, czy enzym b´dzie obecny czy nie – wartoÊç ta nie ule-

gnie zmianie. KorzyÊci zastosowania biokatalizatora sà nast´pujàce:

a) znacznie szybsze osiàgni´cie stanu równowagi (w przybli˝eniu przyspieszenie reakcji –

por. ni˝ej);

b) zmniejszenie energii aktywacji – tej minimalnej porcji energii, która podniesie poziom

energetyczny substratu do progu umo˝liwiajàcego zainicjowanie i przeprowadzenie da-

nej reakcji (por. ryc. 16).

Istnieje tak˝e inne powa˝ne ograniczenie pracy biokatalizatorów. Jest nim problem

energetyczny – w warunkach ustrojowych enzymy mogà przyspieszaç jedynie reakcje egzo-

ergiczne (por. ryc. 16). Czy˝byÊmy mieli wi´c „biochemiczny pat” w wypadku reakcji endo-

ergicznych? Rozwiàzanie jest proste: trzeba w sensownym zakresie podnieÊç poziom

energetyczny substratu, ˝eby reakcja sta∏a si´ egzoergiczna. Jak „do∏adowaç” taki uk∏ad, wy-

jaÊni´ dok∏adniej w ROZDZ. 4.4. Tutaj musisz zadowoliç si´ stwierdzeniem, ˝e istniejà wy-

specjalizowane czàsteczki powstajàce w reakcjach silnie egzoergicznych, gromadzàce

w sobie energi´, którà potem mogà oddawaç na wspomniane do∏adowanie.

KA˚DY ENZYM MA CENTRUM AKTYWNE

Du˝a skàdinàd czàsteczka enzymu ma zawsze na swojej powierzchni ma∏e zag∏´bienie,

które nazwano centrum aktywnym (miejscem aktywnym; por. ryc. 17 i 18). Miejsce aktywne

jest przestrzennym wg∏´bieniem w kszta∏cie rowka lub do∏ka, zawierajàcym odpowiednie

aminokwasy. Ten „do∏ek” jest najwa˝niejszà cz´-

Êcià ca∏ej makroczàsteczki biokatalizatora.

Wchodzi tu bowiem substrat, tutaj tak˝e przy∏à-

cza si´ grupa prostetyczna (o ile wyst´puje).

¸aƒcuchy boczne (R) aminokwasów umo˝liwia-

jà rozpoznawanie, wpasowywanie i reagowanie

konkretnego substratu.

Ryc. 17. Prosty model budowy enzymu

Dlatego cz´sto nazywa si´ je grupami katalitycznymi enzymu . Liczba tych grup jest ró˝-

na (zale˝y od rodzaju enzymu), ale zawsze jest ich kilka do kilkunastu. Rodzaj i rozmieszcze-

nie przestrzenne aminokwasów w centrum aktywnym decyduje o w∏aÊciwoÊciach

konkretnego enzymu (por. ni˝ej klasyfikacja enzymów). Zwykle miejsca te zawierajà zarów-

no kilka niepolarnych, jak i polarnych reszt aminokwasowych, co zapewnia odpowiednie mi-

kroÊrodowisko.

MOLEKULARNE POD¸O˚E BIOLOGII

ENZYMY SÑ SPECYFICZNE WZGL¢DEM SUBSTRATÓW

Budowanie bia∏kowego biokatalizatora kosztuje du˝o energii i materii, a jego trwa∏oÊç

jest ograniczona (por. ni˝ej). Dlatego nale˝y wykorzystaç do maksimum jego mo˝liwoÊci.

Przede wszystkim za∏ó˝my, ˝e komórka musi oszcz´dzaç energi´ i surowce. Oznacza to

mi´dzy innymi, ˝e nie staç jej na przeprowadzanie niepotrzebnych reakcji. Rozwiàzaniem jest

„specjalizacja” enzymów, która prowadzi do tego, ˝e katalizowane sà tylko reakcje po˝àdane.

Innà korzyÊcià jest wysoka sprawnoÊç takich wàskich specjalistów. W porównaniu z kataliza-

torami nieorganicznymi osiàgane pr´dkoÊci sà o kilka rz´dów wielkoÊci wi´ksze. Wymaga to

od enzymów zdolnoÊci do bardzo dok∏adnego rozpoznawania substratów, czyli specyficzno-

Êci substratowej .

Zasadniczo dany rodzaj enzymu przeprowadza tylko jeden rodzaj reakcji. Jest to pewne

rozwini´cie znanej Ci zasady: jeden enzym – jedna reakcja . Nie oznacza to wcale, ˝e enzym

przeprowadza jednà reakcj´ i ulega zniszczeniu. Czàsteczka biokatalizatora nie zu˝ywa si´

bowiem w pojedynczej przemianie – mo˝e przeprowadziç miliony takich operacji (mo˝na to

z grubsza porównaç do popularnego magnetowidu, który odtwarza bezawaryjnie wiele kaset).

Dlatego czàsteczka E widoczna po prawej stronie równania ogólnego (por. ryc.18) mo˝e po-

nownie przeprowadziç t´ reakcj´ z kolejnà czàsteczkà substratu. OczywiÊcie ˝ywotnoÊç ka˝-

dej struktury ma swoje granice – dlatego po jakimÊ czasie czàsteczki enzymu ulegajà

zestarzeniu (zu˝yciu) i ich liczba b´dzie musia∏a byç uzupe∏niona (z magnetowidem b´dzie

podobnie).

Enzymy ró˝nià si´ od siebie specyficznoÊcià, co jest zjawiskiem po˝àdanym, ale tak˝e nie-

bezpiecznym (por. ni˝ej inhibicja). Dla przyk∏adu

-amylazy naszego przewodu pokarmowe-

-glikozydowego i nie ma tu wi´kszego znaczenia, czy

substratem jest skrobia, glikogen czy dekstryna.

Uwaga: Nie oznacza to jeszcze, ˝e amylazy dzia∏ajà „na Êlepo” – por. CZ¢Âå: ANATOMIA I …,

ROZDZ. 5.

Ryc. 18. Model ilustrujàcy przestrzenne dopasowanie substratu i enzymu wed∏ug modelu zamka

i klucza

Podobnie lipaza trzustkowa rozk∏ada wiàzania estrowe w ró˝nych t∏uszczach. Inne enzy-

my wykazujà znacznie wi´kszà dok∏adnoÊç w rozpoznawaniu substratu, na przyk∏ad anhydra-

za w´glanowa katalizuje tylko reakcje pomi´dzy dwutlenkiem w´gla i wodà. Inny

go rozk∏adajà wiàzania typu

4. Wprowadzenie do enzymologii

biokatalizator – polimeraza DNA I (przeprowadzajàca reakcje kopiowania DNA) w∏àcza do

syntetyzowanej nici nowe nukleotydy z dok∏adnoÊcià jednego b∏´du na 10 000 000 przepro-

wadzonych operacji.

SpecyficznoÊç enzymów dobrze oddaje model zamka

i klucza, sformu∏owana przez pana Fishera ju˝ w 1890 r.

Mówi ona, ˝e substrat pasuje do centrum aktywnego

enzymu tak jak klucz do zamka (por. ryc. 18).

Po prostu – odpowiednie ukszta∏towanie przestrzenne substratu znajduje odbicie w kon-

formacji miejsca aktywnego enzymu. Pozwala to na wejÊcie grup katalitycznych enzymu

w nietrwa∏e po∏àczenia z substratem i przeprowadzenie reakcji. Model Fishera jest prosty

i przekonywajàcy, nie wyjaÊnia jednak wszystkich aspektów katalizy enzymatycznej w ˝ywych

uk∏adach. Modelowanie matematyczne udowodni∏o bowiem, ˝e samo dopasowanie S do

E daje tylko dwie pierwsze z wymienionych wczeÊniej korzyÊci (przypomnij je sobie!). Nie po-

zwoli∏yby one na tak znaczne obni˝enie energii aktywacji. WyjaÊnienie tego problemu przed-

stawi∏ pan Koshland w swojej teorii indukcyjnego dopasowania (wymuszonego

dopasowania). W tym uj´ciu substrat niezbyt dok∏adnie pasuje przestrzennie do centrum ak-

tywnego. Inaczej mówiàc, konformacja obu sk∏adowych kompleksu E-S nie jest identyczna.

Otó˝ wchodzàc w s∏abe oddzia∏ywania z enzymem, S jest przez niego „wciàgany” do zag∏´bie-

nia centrum. W czasie dopasowywania nast´puje pewne odkszta∏cenie centrum i substratu.

Mo˝na wi´c oczekiwaç niewielkiego napr´˝enia (mniej wi´cej naderwania) wiàzaƒ w obu

komponentach. W tej sytuacji ju˝ niewielka porcja energii aktywacji wystarcza do pokonania

progu energetycznego reakcji. To, ˝e dochodzi do zmiany wiàzaƒ tylko w substracie, t∏umaczy

si´ czasem wielkoÊcià czàsteczki enzymu – przewaga masy daje mu wi´kszà stabilnoÊç i mniej-

szà podatnoÊç na odkszta∏cenia. Mamy wi´c tutaj wszystkie trzy przedstawione korzyÊci.

Czasem dla obrazowego wyjaÊnienia teorii Koshlanda mówi si´, ˝e substrat pasuje do

miejsca aktywnego jak r´ka do r´kawiczki (przemyÊl to dok∏adnie).

KINETYK¢ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ OBRAZUJE MODEL MICHAELIS-MENTEN

Ju˝ w 1913 roku panie Michaelis i Menten przedstawili bardzo prosty model charaktery-

zujàcy dynamik´ przebiegu katalizowanych reakcji. Za∏o˝eniem by∏o oczywiÊcie, ˝e zawsze

tworzy si´ kompleks E-S jako poÊredni etap ca∏ego procesu. W swojej podstawowej wersji

tzw. równanie Michaelis-Menten przyjmuje nast´pujàcà postaç (po uproszczeniu!):

gdzie V – pr´dkoÊç katalizowanej reakcji, V max – pr´dkoÊç maksymalna jakà mo˝na by∏o-

by teoretycznie osiàgnàç w warunkach optymalnych, [S] – st´˝enie substratu, K M – sta∏a Mi-

chaelis. Ta ostatnia jest równa takiej wartoÊci st´˝enia substratu, przy którym pr´dkoÊç reakcji

jest równa po∏owie pr´dkoÊci maksymalnej (por. ni˝ej).

Nie wdajàc si´ w zawi∏e wyjaÊnienia, spójrzmy na to równanie kraƒcowo:

1. JeÊli st´˝enie substratu jest bardzo du˝e, to wówczas mo˝emy w u∏amku pominàç K M (sta-

∏a ta ma niewielkà wartoÊç rz´du od 10 –1 do 10 –7 mola/litr). Równanie uproÊci si´ i przyjmie

praktycznà postaç:

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: