Tak jak wspominałem państwu ostatnio układ hemostazy, czyli układ który zabezpiecza krew przed opuszczeniem przez nią w sposób nieoczekiwany łożyska naczyniowego obejmuje kilka elementów. Nas interesuje wyłącznie ten układ, który jest układem białek osocza czyli układ krzepnięcia i fibrynolizy.
Przypominam państwu również, że krzepnięcie polega na przemianie fibrynogenu w fibrynę. Fibrynogen jako białko rozpuszczalne w wyniku działania trombiny staje się białkiem nierozpuszczalnym, to nie jest jeszcze ostatni moment bo jeszcze musi być powstały skrzep stabilizowany. Zarówno w układzie krzepnięcia jak i fibrynolizy mamy dwie drogi, drogę wywnątrzpochodną i drogę zewnątrzpochodną. Proces krzepnięcia zaczyna się od aktywacji układu zewnątrzpochodnego. Mamy trzy układy
Etapy w układzie
w układzie krzepnięcia, które mają doprowadzić do powstania włóknika czyli fibryny. W pierwszym etapie aktywacja czynnika X. Od tego momentu rozpoczyna się wspólna droga krzepnięcia krwi. W następnym etapie ma być utworzenie protrombiny czyli aktywnego czynnika, który przemienia nam fibrynogen w fibrynę i to jest trzeci etap kaskady krzepnięcia krwi. Przypominam państwu również o czynnikach krzepnięcia krwi
czynniki niebiałkowe i czynniki białkowe
zespół protrombiny (II,VII, IX, X )
pierwszy układ krzepnięcia krwi będzie oddzielnie omawiany ponieważ jest on zależny od witaminy K. W procesie posttranslacyjnej gammakarboksylacji, szczegółowo jak to zachodzi będzie mowa przy witaminie K ale już tą modyfikacje omówiłem przy karboksylacji białek powstaje kwas gammakarboksyglutaminowy, dla działania tych czynników krzepnięcia podobnie także dla pozostałych kluczowe znaczenie mają jony Ca
Ca2+
i w wyniku powstania reszt kwasu gammakarboksyglutaminowego te czynniki zyskują możliwość wiązania się z wapniem. Drugą grupą czynników są czynniki wrażliwe na trombinę
( I, V, VIII, XIII )
tu zasadniczym substratem dla trombiny jest fibrynogen jak i inne czynniki, które poprzez trombinę ulegają autokatalizie czyli następuje ich ponowna aktywacja. Tutaj w przeciwieństwie do układów hormonalnych gdzie obowiązuje system sprzężeń zwrotnych ujemnych w układzie krzepnięcia spotykamy się z systemem sprzężeń zwrotnych dodatnich. Czyli produkt reakcji aktywuje reakcje w wyniku której powstał, stąd bardzo precyzyjna jest kontrola układu krzepnięcia krwi i fibrynolizy a defekty prowadzą do bardzo poważnych konsekwencji wraz ze
ze
zgonem włącznie. Nie trzeba nikomu przypominać, że jeśli komuś zaczyna krzepnąć krew wewnątrznaczyniowo to niczego dobrego to nie wróży. No i wreszcie trzecia sprawa obecność czynników
czynniki kontaktu ( XI, XII, prekalikreina, HMWK )
, które są niezbędne do aktywacji drogi wewnątrzpochodnej, czyli to co państwo robiliście na ćwiczeniach czyli pałeczka do pobranej krwi i wykrzepianie włóknika kontakt, przy czym w układzie krzepnięcia ze szkłem zazwyczaj nie mamy do czynienia. I również należy pamiętać, że większość są to enzymy proteolityczne z grupy proteaz serynowych, które występują w formie proenzymu i kaskadowo ulegają aktywacji. Bardzo ważne są czynniki V i VIII to są kofaktory reakcji wysokocząsteczkowy
HMWK -
kininogen jest białkiem osoczowym no i wreszcie czynnik XIII to jest transglutaminaza - enzym, który doprowadza do stabilizacji
włóknika. Pierwszy etap - mianowicie aktywacja czynnika X czyli spotkania się drogi zewnątrzpochodnej z wewnątrzpochodną (schemat ideowy na tablicy). Małą literką „a”(activated) oznaczamy czynniki aktywowane, a naszym celem jest dojście do aktywacji czynnika X. Poczynając od drogi wewnątrzpochodnej czynnik XII zwany czynnikiem Hagemana
synteza czynnika w wątrobie
. Jeśli mamy do czynienia z
standardowym kontaktem, czynnik XII zaczyna się stykać w warunkach probówki z powierzchnią szklaną natomiast w układzie in vivo może się zetknąć np. z kolagenem, z kwasami tłuszczowymi, które uległy uszkodzeniu i następnie mogą aktywować enzymy tak nieswoiste jak trypsyna, ale również enzymy swoiste zaangażowane w ten proces takie jak kalikreina, która występuje jako prekalikreina, oraz plazmina. W wyniku kontaktu z ta
taką
powierzchnią ujemnie naładowaną powstaje aktywny czynnik XII, czynnik oznaczony jako czynnika „a
XIIa
”. Czynnik XII należy do enzymów proteolitycznych jest proteazą serynową. Po rozwinięciu swojej aktywności z proenzymu powstaje enzym, który działa na prekalikreinę i powstaje kalikreina. Kalikreina jest enzymem proteolitcznym działającym na różne substraty osoczowe ( i to jest przyczynek do tych tygodniowych rozważań na temat enzymów). Jako kanał
? kanon
w każdej książce znajdą państwo informacje, że enzym to jest takie białko które wykazuje aktywność do:
a. katalizowanej reakcji
b. wobec substratu
To jest bardzo duże uproszczenia, bo jak dzisiaj państwo się przekonają w układzie krzepnięcia krwi każdy z tych enzymów ma wiele różnych substratów, do jednych ma większe do innych ma mniejsze powinowactwo, które mierzymy skalą Michaelisa natomiast niewiele jest enzymów, które działają tylko na jeden substrat i podobnie w toku dalszej edukacji zobaczymy, że jeden enzym może przeprowadzać różne reakcje uzależniając się od swojej budowy molekularnej i struktury, także to jest dogmat który bardzo łatwo obalić o swoistości enzymu do swojej reakcji i substratu. Kalikreina działa na wysokocząsteczkowy kininogen, który jest też białkiem osocza ten skrót powszechnie używany HMWK. Odszczepia pewne peptydy od tego wysokocząsteczkowego kininogenu, następnie powstały kompleks działa ponownie na czynnik XII i następuje jego aktywacja do czynnika XIIa, mamy do czynienia z reakcją autokatalizy powstałe produkty ponownie aktywują czynnik XIIa
XII
. Końcowym produktem tego szlaku (jak już się naprodukuje tego czynnika XIIa w miarę dużo), następuje jego akcja na czynnik XI zwany czynnikiem Rozentala i powstaje czynnik XIa. Powstaje pytanie co się dzieje jeżeli do czynników kontaktów do których zaliczamy czynnik XII, prekalikreinę oraz wysokocząsteczkowy kininogen
?
... . Takie defekty w biologii człowieka w medycynie są znane. Otóż tak naprawdę nie dzieje się nic, dlaczego? Wyjaśnię: czynnik XIIa jako enzym proteolityczny działa na różne substraty, nie jest jego jedynym zadaniem aktywacja czynnika XI do XIa w układzie wewnątrzpochodnym. On również aktywuje prekalikreinę do kalikreiny czyli ten enzym, który działa na wysokocząsteczkowy kininogen czyli ma kolejny punkt sprzężenia zwrotnego dodatniego. Dalej jest to również enzym, który działa w zakresie fibrynolizy czyli procesu przeciwstawnego do krzepnięcia. Mianowicie dochodzi do aktywacji pro
proaktywatorów
aktywatorów plazminogenu. Aktywatory plazminogenu, dwa najważniejsze o których będę mówił w dalszej części wykładu są pro
proenzymami
enzymami i w wyniku działania m.in. aktywnego czynnika XIIa powstają aktywne aktywatory plazminogenu. No i wreszcie czynnik XII jest zaangażowany w układ zewnątrzpochodny a mianowicie w przemianę czynnika VII w czynnik VIIa. Czynnik VIIa jest najważniejszym czynnikiem krzepnięcia w układzie zewnątrzpochodnym. Tak więc zaktywowaliśmy czynnik XII, a teraz zajmiemy się aktywacją czynnika XI. Czynnik VII również przez czynnik XII może być aktywowany. Aktywacja czynnika XI do XIa zachodzi pod wpływem czynnika XIIa czyli czynników kontaktów. Mogą występować defekty w zakresie czynników kontaktu i wtedy by znaczyło, że układ krzepnięcia nie jest aktywowany, tak w rzeczywistości nie jest ponieważ istnieją co najmniej dwie drogi aktywacji czynnika XIa co sprawia, że u tych osób defekt klinicznie może być niezauważalny, wtedy osoby te nie mają problemów z krzepnięciem krwi nawet przy bardzo skomplikowanych zabiegach chirurgicznych. Dzieje się tak dlatego, że trombina, enzym którego głównym substratem jest fibrynogen również potrafi aktywować czynnik XI, również płytki krwi biorą udział w aktywacji czynnika XI. Tak więc mimo defektów w zakresie czynników kontaktu aktywacja drogi zewnątrzpochodnej zachodzi w procesie zależnym od trombiny. Celem działania czynnika XI jest wytworzenie pewnego kompleksu enzymatycznego, który nosi nazwę tenaza. Główną częścią tenazy jest aktywny czynnik IXa. Jak wspominałem na wstępie czynnik VIII jest kofaktorem reakcji to nie jest enzym. Czyli kompleks tenazy obejmuje aktywny czynnik IXa, a jednym z kofaktorów jest aktywny czynnik VIII. No i mamy nasz czynnik IX, na który działa poprzedni zaktywowany czynnik XIa i powstaje aktywny czynnik IXa. Nie jest to jedyny sposób aktywacji czynnika IX. Tutaj również duże znaczenie ma aktywacja drogi zewnątrzpochodnej, mianowicie aktywny czynnik VII w kompleksie z fosfolipidami płytek krwi, głównie z fosfatydylocholiną i z fosfatydyloseryną przy udziale jonów Ca
, również potrafi zaktywować czynnik IX. Jak państwo pamiętacie proces krzepnięcia krwi zaczyna się od aktywacji drogi zewnątrzpochodnej, po wytworzeniu aktywnego czynnika VII nie tylko on wpływa na aktywację czynnika X, gdzie się odbywa wspólna droga końcowa ale równocześnie potrafi zaktywować czynnik IX do postaci IXa. Czyli już na wstępnym etapie następuje sprzęgnięcie drogi wewnątrzpochodnej z drogą zewnątrzpochodną. Czynnik IXa wspólnie z czynnikiem VIIIa jako kofaktorem reakcji i fosfolipidami błonowymi takimi jak: fosfatydylocholiną czyli lecytyną i fosfatydyloseryną i jonami Ca
tworzy kompleks aktywny zwany tenazą. Jest to kompleks enzymatyczny, który aktywuje czynnik X. W jaki sposób powstaje aktywny czynnik VIII czyli VIIIa. Czynnik VIII pływa sobie w osoczu w kompleksie z innym czynnikiem krzepnięcia o nazwie czynnik von Willebranda(vWS). Po zadziałaniu czynników proteolitycznych albo trombiny albo aktywnego czynnika Xa (widzimy tutaj wzmocnienie reakcji poprzez sprzężenie zwrotne dodatnie), następuje oddysocjowanie, hydrolizowanie czynnika von Willebranda, odjeżdża sobie i powstaje aktywny czynnik VIII, (nie jest enzymem tylko kofaktorem czynnika IXa). Powstaje tenaza, tenaza wpływa na czynnik X do
aktywując go
czynnika Xa, odwrotnie wpływa na czynnik VIII. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że gdzieś tam w końcowym etapie z protrombiny powstaje trombina , która ponownie działa na czynnik VIII i zwrotnie go aktywuje. Defekt w zakresie kodowania czynnika VIII, czyli zmniejszenie jego syntezy prowadzi do hemofilii A. Hemofilia ta ma różne poziomy ciężkości : może być bardzo ciężka, może być mniej ciężka w zależności od ilości tego czynnika. Bardzo ciężkie objawy krwawienia dostawowego wymagające przetoczeń koncentratu. Wylewy dostawowe powodują usztywnienie stawów, wylewy domięśniowe często występujące u dzieci, praktycznie nie występują bo poziom czynnika jest rzędu kilkunastu procent. Co to jest czynnik von Willebranda? choroba von Willebranda opisana na początku wieku jest chorobą bardzo rzadką, dlatego nie będzie nas interesować. Natomiast czynnik von Willebranda można dość łatwo oznaczyć metodami immunoenzymatycznymi. Oznacza się to po to, aby stwierdzić czy doszło do aktywacji śródbłonka naczyniowego.
VCAM 1, ICAM 1 AIKAM1
Śródbłonek
Światło naczynia krwionośnego
Krew
Jeśli jakieś czynniki szkodliwe działają na śródbłonek np. może być hypercholesterolemia, która jest bardzo częstym czynnikiem ryzyka populacji lub nadciśnienie tętnicze lub niewyrównana cukrzyca na powierzchni śródbłonka zaczynają pojawiać się różne struktury, które normalnie ekspresji nie ulegają to mogą być np. molekuły adhezyjne najczęściej jest to VIKAM
VCAM 1, ICAM 1
1, AIKAM 1 może być również czynnik von Willebranda. Czynnik von Willebranda jest bardzo ważnym kofaktorem w reakcji między śródbłonkiem a płytkami krwi. Na płytkach krwi występują dwa receptory i dzięki połączeniu z czynnikiem von Willebranda zaczyna się tworzyć agregat przyścienny płytek krwi, zaczyna się zakrzepica. Jeśli ekspresji ulegają molekuły adhezyjne to w otoczeniu znajduje się jakiś monocyt i bardzo chętnie przylepia się do takiej molekuły adhezyjnej, wchodzi sobie pod śródbłonek naczyniowy, przekształca się w makrofag, i od tego zaczyna się proces miażdżycy tętnic. Ale to jest kwestia czysto histopatologiczna. A pytanie brzmi, co z tego lekarz praktyk może mieć, im więcej ulegają ekspresji molekuły jak i czynnik von Willebranda tym więcej tych czynników złuszcza się z powierzchni śródbłonka. One w formie wolnej znajdują się w osoczu i metodami immunoenzymatycznymi można je oznaczyć i na tej podstawie wnioskować o stanie śródbłonka naczyniowego. Im kto ma wyższy poziom czynnika von Willebranda, fruwającego sobie w osoczu tym jego perspektywy są mniej świetlane. Większe ryzyko zakrzepicy tętniczej oraz jest to czynnik powstawania zawałów serca, udarów mózgu oraz powstawania zakrzepicy w płucach. A więc nie jest to badanie sztuka dla sztuki, aby badając wpływ czegoś na coś, uzyskać coś, ale jest to ważny marker biochemiczny i nie jest to wykonywane tylko dziś w USA ale również takie badania prowadziliśmy i prowadzimy i są one interesujące. Oznaczenia na tym etapie są kosztowne i nie są to oznaczenia rutynowe typu OB czy liczba leukocytów ale są to oznaczenia o dużej wartości naukowej. To był marker aktywacji śródbłonka a jego funkcja to funkcja zarówno w:
a. hemostazie pierwotnej, zależnej od płytek krwi
b. hemostazie wtórnej, zależnej od osoczowego układu krzepnięcia
Hemostaza pierwotna:
Na powierzchni płytek krwi następuje ekspresja różnych receptorów, z punktu widzenia praktycznego ważne są dwa receptory:
a. GP1B
GP Ib
+ vWS ekspresja na pow. śródbłonka,
następuje moment zetknięci płytki ze śródbłonkiem to nosi nazwę adhezji.
Genetyczny defekt receptora GP1B
nosi nazwę Trombastenii Glanzmana następuje zaburzenie krzepnięcia krwi, które nazywamy czasem krzepnięcia krwi czyli czasem, który mówi nam o aktywności płytek krwi.
Bardzo ciekawa i zgłębiana naukowo jest glikoproteina 2p
IIb/IIIa
/3a pośredniczy w kontakcie z czynnikiem von Willebranda, a nadto jest aktywna w procesie agregacji czyli łączenia się płytek ze sobą tworząc konglomerat płytkowy, czyli zakrzep przyścienny. Zainteresowanie tym problemem jest na tyle duże, że w ostatnich latach wytworzono szereg leków, które skutecznie mogą zablokować ten receptor i są w wielu krajach rutynowym postępowaniem w zawale mięśnia sercowego, bowiem hamują zakrzepicę w naczyniach wieńcowych, jedynym blokiem w ich stosowaniu jest wysoka cena, która oscyluje w granicy 1000$ za iniekcje. Jest to bowiem przeciwciało monoklonalne, czyli uzyskane w wyniku immunizacji organizmu myszy. Wycina się tej myszy śledzionę i limfocyty uczulone czynnikiem gp2p3a
GP IIb/IIIa
izoluje się i dokonuje się hybrydyzacji z komórkami nowotworu zwanego szpiczakiem mnogim, czyli takim niepohamowanym syntetyzatorem immunoglobulin, skłania się do nadprodukcji immunoglobulin właśnie tych, o które nam chodzi czyli gp2p3a
i takiemu pacjentowi wstrzykuje się ten preparat. Blokuje się ten receptor, w Polsce ze względów ekonomicznych nie przeprowadza się takiego postępowania.
Hemostaza wtórna:
Funkcja transportowa czynnika VIII włącznie z czynnikiem von Willebranda.
Są tu monomery czynnika von Willebranda, które układają się w strukturę polimeryczną, najczęściej są to trzy lub cztery cząsteczki czyli trimer albo tetramer i dzięki temu połączeniu czynnik VIII, który jak pamiętamy jest wrażliwy na działanie różnych enzymów proteolitycznych m.in. trombinę. Jeśli trombina zadziała to jest wszystko w porządku, bo następuje odcięcie tam gdzie powinno być i powstaje aktywny czynnik VIII. Jeśli zadziałałby inny czynnik to zdegradowałby nam a nie zaktywował. To jest przykład ograniczonej proteolizy a nie proteolizy totalnej. Dlatego jest to transportowane w kompleksie z czynnikiem von Willebranda. Jeśli zadziałają aktywatory czynnika VIII, czyli trombina i czynnik X cięcie następuje w tym miejscu gdzie powinno. Czynnik von Willebranda oddysocjowuje, natomiast czynnik VIII staje się czynnikiem VIIIa i razem z czynnikiem IXa i fosfolipidami staje się aktywną tenazą. Doszliśmy do powstania tenazy czyli IXa, VIIIa, fosfolipidy błonowe i jony wapnia i teraz drogą działania jest czynnik X, który jest wspólną drogą dla drogi zewnątrzpochodnej i wewnątrzpochodnej. Czynnik X może być aktywowany wewnątrzpochodnie , czyli jest to działanie tenazy jak i na drodze zewnątrzpochodnej , czyli przy udziale czynnika VII aktywnego, fosfolipidów i jonów wapnia. Czynnik X nie ma tylko drogi aktywacji w dół czyli aktywacji protrombiny w trombinę ale również zwrotnie aktywuje szereg czynników krzepnięcia, czyli wzmaga autokatalitycznie drogę krzepnięcia. Jest to bardzo ważny czynnik bo jego aktywacja docelowo prowadzi do aktywacji protrombiny w trombinę, istnieje cały układ regulacyjny tegoż czynnika, mianowicie w osoczu krwi występują antyproteazy, (gdzie czynnik Xa jest proteazą serynową) które ten czynnik hamują. Najważniejszą antyprotezą jest antytrombina III, która jest naturalnym inhibitorem krzepnięcia, która jest kofaktorem heparyny. Jednym z najważniejszych punktów uchwytu heparyny podawanej w celach terapeutycznych jest jej wiązanie się z antytrombiną dla zahamowania czynnika X. Jak łatwo zgadnąć krzepnięcie krwi jest u nas kontrolowane bez podawania heparyny to z tego wynika, że antytrombina III jest również bez podawania heparyny inhibitorem czynnika X, przy czym przy obecności heparyny jej powinowactwo rośnie kilkaset krotnie do czynnika X i dlatego efekt terapeutyczny jest większy niż w warunkach podstawowych. Kolejnym białkiem jest kofaktor heparyny II w skrócie HC II. Jest to także białko, które podobnie jak antytrombina III wiąże heparynę przez co zwiększa swoje możliwości antykrzepliwe, następnie są ostatnio odkryte białka zwane antystatyną czy aneksyną. Aneksyna V jest białkiem produkowanym przez ścianę naczyniową, która bardzo silnie wiąże się z fosfolipidami i uniemożliwia aktywację czynnika X do Xa, do tego również potrzebne są fosfolipidy tak jak do aktywacji innych czynników krzepnięcia, czyli na każdym etapie rola płytek krwi nam się pojawia. Bardzo ważnym białkiem jest trombomodulina TM, ulega ono ekspresji na powierzchni śródbłonka naczyniowego. Dalej mamy grupę białek ukochanych przez ścianę naczyniową, niektórzy mówią że pięć, inni że sześć, które hamują czynnik Xa. Oraz wzajemna gra między inhibitorami czynnika X oraz jego aktywatorami wpływa na to czy krzepnięcie przebiega z dużym nasileniem czy też nie. Aktywny czynnik X czyli Xa swoją filozofią działania przypomina czynnik IX, on również posiada swój kofaktor, którym jest czynnik VIII aktywny, natomiast dla czynnika Xa aktywnym kofaktorem jest czynnik Va i podobnie jak poprzednio fosfolipidy (fosfatydyloseryna i fosfatydylocholina) oraz jony
Ca. Tamten kompleks nazywaliśmy tenazą a ten kompleks nazywamy protrombinazą. Substratem dla protrombinazy jest białko produkowane przez wątrobę, które jest czynnikiem II czyli protrombiną. Protrombina jest proenzymem z niej pod wpływem protrombinazy powstaje trombina, enzym proteolityczny. Podobnie jak aktywacja czynnika VIII do VIIIa zachodziła pod wpływem czynnika X aktywnego i trombiny, podobnie aktywacja czynnika V zachodzi pod wpływem czynnika Xa czyli jest to czynnik, który ma wiele punktów uchwytu a nie jedynie aktywację protrombiny do trombiny. Doszliśmy do momentu kiedy powstała protrombinaza, czyli Va, Xa i fosfolipidy i jony
Ca, i ma ona za zadanie odciąć część pro- od protrombiny aby powstała trombina aktywna.
Teraz zajmiemy się drugą drogą równie istotną...
Jacek-Paulina