Żymańczyk-Duda, mikrobiologia, IZOLOWANIE CZYSTYCH KULTUR.docx

IZOLOWANIE CZYSTYCH KULTUR

Klon – mikroorganizmy pochodzące od jednej komórki – jednorodne genetycznie (czysta kultura)

Szczep – mikroorganizmy jednego gatunku wyprowadzone z różnych klonów (poszczególne szczepy tego samego gatunku mogą różnić się właściwościami, dlatego mogą rosnąć na różnych pożywkach)

1. Posiew redukcyjny na agarze odżywczym (zestalenie agar-agarem – ciekły do 44st.C, topi się 85st.C) – robi się różne wzorki na płytkach, żeby rozcieńczyć naszą hodowle na płytce.

2. Metoda płytek lanych – rozcieńczamy hodowlę komórek w probówkach z użyciem płynu fizjologicznego (najczęściej 10^-1), następnie z kilku kolejnych probówek pobieramy komórki i wylewamy na płytkę, którą zalewamy płynnym agarem, mieszamy pipetą, by równomiernie rozprowadzić komórki, gdy agar się zestala, kom zatrzymują się w tych miejscach, w których się obecnie znajdują, przechowuje się je do góry dnem

3. Metoda szeregu rozcieńczeń – różni się tym, że posiew wylewamy na gotową płytkę z agarem. Na płytkę posiew wylewamy pipetą i rozprowadzamy równomiernie. Dążymy do tego, żeby kolonii było jak najmniej.

PRZECHOWYWANIE MIKROORGANIZMÓW

Przechowywanie nie powinno wpłynąć na cechy morfologiczne i chemiczne naszej hodowli

1. Skosy mikrobiologiczne – podłoża stałe w probówkach – najprostszy sposób, probówki zakleja się i umieszcza w lodówce

2. Wkłucia w podłoża stałe – stosuje się do mikroorganizmów beztlenowych, bo wprowadza się je do dna naszej probówki i zakleja ją parafiną – odcina się tlen, zmniejsza ich metabolizm

3. Liofilizacja – I etap: schładza się hodowle szybko do -700 stopni (nie niszczą się struktury), następnie II etap: suszy się pod próżnią (wody nie może być więcej niż 1%), ważne jest stosowanie czynników ochronnych stabilizujących białka, enzymy, żeby ich nie uszkodzić

4. Ciekły azot – stabilizacja glicerolem lub DMSO – w stężeniu 5-10% w stosunku do roztworu. Glicerol jest dobry, bo utrwala białko

HODOWLE WZBOGACAJĄCE, NAMNAŻAJĄCE

Stosuje się je, gdy chcemy wyizolować czystą kulturę, ważne jest częste przeszczepianie hodowli, pożywkę stosuje się pod tylko jeden typ mikroorganizmów, preferując ich wzrost

Selektywne faworyzowanie jednego gatunku – izolacja – inhibitor będzie faworyzował jeden mikroorganizm, a hamował wszystkie inne

Podłoża selektywnie różnicujące (np. Podłoże Mac Conkey’a – rozróżnienie w obrębie pałeczek – koliformy (E. coli, Salmonella, Shigella))

Przebieg procesu różnicowania:

·         fiolet krystaliczny –inhibicja G(+)

·         fermentacja laktozy (E. coli) obniża pH, wtedy czerwień obojętna zyskuje kolor czerwony

·         sole żółciowe krystalizują na żółto wokół kolonii, które fermentują laktozę

·         brak fermentacji laktozy – barwa biała wokół kolonii – Salmonella, Shigella

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA WZROST MIKROORGANIZMÓW

1.      pH – nawet najmniejsza zmiana ich stężenia może bardzo wpłynąć na właściwości pożywki (są to najszybciej poruszające się jony), ważne jest też, żeby pH nie zmieniało się znacząco podczas hodowli– bakterie preferują alkaiczne pH=8, a grzyby poniżej 7, neutrofile w pH obojętnym, acydofile w kwaśnym, alkalofile w zasadowym. Może dojść do samozatrucia hodowli, dlatego pożywki muszą być wcześniej buforowane (np. bakterie preferujące wyższe pH mogą wydalać jakiś kwas i może dojść do samozatrucia)

2. Stosunek do obecności tlenu – stężenie tlenu w probówkach jest najwyższe na górze, a najniższe na dole (wyróżniamy: aeroby – wymaga obecności tlenu, anaeroby – tlen jest dla nich toksyczny, anaeroby fakultatywne, anaeroby tolerujące O2 te dwie mogą rosnąć przy obecności i przy braku tlenu – energie pobierają albo na zasadzie fermentacji albo z oddychania komórkowego, mikroacerofile – wymagają niskich stężeń tlenu)

3. Stosunek do temperatury

·         punkt śmierci cieplnej – temperatura, w jakiej hodowla ginie w ciągu 10 minut

·         czas śmierci cieplnej – minimalny czas potrzebny do zabicia hodowli w danej temperaturze

·         - temperatura optymalna – temperatura, przy której organizm osiąga optymalne tempo wzrostu – nie idzie w parze z temperaturą optymalną enzymów – używana przy intensywnych namnażaniu, ale czasami, gdy obserwujemy proces metaboliczny warto ją zmienić pod względem temperatury optymalnej danego enzymu.

·         - temperatura minimalna i maksymalna – temperatura, po przekroczeniu której organizm zamiera

·         - psychrofile – optimum 15 stopni (0-20)

·         - mezofile – optimum 30 stopnii (20-40)

·         - termofile – (40-70)

·         -termofile ekstremalne – (65-90)

·         - hipertermofile

4. Ciśnienie

·         Hydrostatyczne – barofile – wymagają bardzo wysokiego ciśnienia

·         Osmotyczne – osmofile (np. 7,5% NaCl – Staphylococcus aureus)

·         Halofile – obligatoryjne osmofile – nie stężenie soli, a np. stężenie cukrów czy innych czynników

DYNAMIKA WZROSTU BAKTERII

1. Szybkość wzrostu – czas generacji – czas potrzebny komórce do podzielenia się (czas pomiędzy podziałami)

2. Charakterystyka wzrostu w hodowli stacjonarnej (ograniczenia: ubytek składników odżywczych; toksyny)

·         Lag faza – komórki rosną nie dzielą się – od momentu zaszczepienia do rozpoczęcia podziałów

·         Faza logarytmiczna – stały czas generacji; najszybszy wzrost; do zmian w podłożu; komórki fizjologicznie identyczne; wzrost zrównoważony – jednakowe zmiany składu chemicznego

·         Faza stacjonarna – stała liczba komórek – równowaga; spada dynamika anabolizmu, w ostatnich chwilach degradują białka, rybosomy, wszystkie rezerwy zapasowe

·         Faza zamierania – spada liczba komórek; spory; cysty, ciała olbrzymie – w pożywce nie ma już nic, komórki giną z powodu toksyn i braku substancji odżywczych

DIAUKSJA – WZROST DWUFAZOWY – PODWÓJNY CYKL WZROSTU

Wymaga indukcji enzymów umożliwiających wykorzystanie nowego źródła węgla dostarczonego do podłoża

Wzrost dwufazowy obserwowany jest przy mieszaninie substratów. Najpierw wytwarzane są enzymy do trawienia np. glukozy, dopiero gdy stężenie glukozy spadnie do zera rozpoczyna się syntetyzowanie enzymu rozkładającego np. sorbitol i znowu mamy wzrost logarytmiczny dopóki on się nie skończy w pożywce

OZNACZANIE LICZBY MIKROORGANIZMÓW W OKREŚLONEJ OBJĘTOŚCI (INOCULUM)

Liczbę mikroorganizmów wyznacza się najczęściej dla hodowli synchronicznych – populacja komórek dzieląca się w tym samym czasie (temperatura, składniki odżywcze, światło, filtry)

1. Wyznaczanie całkowitej liczby komórek mikroskopowo – liczy się zarówno komórki żywe i martwe – próbkę dzieli się na kwadraty i liczy w nich komórki, następnie wydziela się średnią. Nie powinno się brać pod uwagę kwadratów stykających się by uzyskać jak najwiarygodniejszy wynik

2. Wyznaczanie liczby żywych komórek – metoda płytkowa szeregu rozcieńczeń

PRZEDŁUŻANIE HODOWLI – HODOWLE CIĄGŁE – UKŁAD OTWARTY

1. Chemostat – w nim prowadzi się hodowle, jest ciągle napowietrzany, gdyż napowietrzanie sprawia, że metabolity i pożywka są równo rozmieszczone, podobnie stężenie tlenu – nie da się rozróżnić faz jak dla stacjonarnego

2. Turbidostat – stała gęstość optyczna hodowli – ciężej jest utrzymać hodowlę o stałej gęstości optycznej, dlatego jest stosowany rzadziej

KONTROLA WZROSTU MIKROORGANIZMÓW

Sterylność – brak wszelkich form mikroorganizmów

Aseptyczność – brak organizmów zakażających i czynników infekcyjnych

Wzrost bakterii można kontrolować poprzez:

·         Filtrowanie

·         Zabijanie (czynniki bakteriobójcze) – przeprowadzają lizę komórek

·         Zahamowanie wzrostu, reprodukcji (czynniki bakteriostatyczne) – po ich usunięciu hodowla ma szansę na normalny rozwój, bo tylko hamują podziały a nie niszczą komórki

Filtry membranowe – pory są mniejsze niż średnica bakterii, bakterie zostają na filtrze:

·         Celuloza – octan celulozy

·         Prasowana ziemia okrzemkowa

·         Syntetyczne polimery: nylon, nitroceluloza – obecnie najpowszechniej stosowany