Plemniki jako wektory do orzymywania zwierzat transgen.pdf

PRACE PRZEGL¥DOWE

Plemniki jako wektory DNA

w uzyskiwaniu zwierz¹t

transgenicznych

Joanna Jurkiewicz

Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t, Instytut Zootechniki, Kraków

Sperm cells as DNA vectors for production of transgenic animals

Summary

The transgenic animals are obtained mainly by microinjection of exogenous

DNA into male pronuclei of the zygote. The efficiency of this method is not sat-

isfactory, especially in domestic animals. Using the sperm cells as vectors for

transfering exogenous DNA sequences into the oocyte during the process of fer-

tilization seems to be an easy and simple method for production of transgenic

animals. It was discovered that sperm cells of all species show the spontaneous

ability to take up exogenous DNA. Exogenous DNA binding is not accidental, it

always occours in the postacrosomal segment of the sperm head. The interac-

tion is ionic, reversible, sequence – independent, and not restricted to DNA,

but can be reproduced using other negetively charged macromolecules. The in-

troduction of DNA into sperm cells is possible using different methods, how-

ever, any of these methods could be considered as a routine one. The mecha-

nisms of taking up and associationig DNA by sperm are being constantly re-

vealed and better understood.

Key words:

sperm cells, exogenous DNA, transgenic animals.

Adres do korespondencji

Joanna Jurkiewicz,

Dzia³ Biotechnologii

Rozrodu Zwierz¹t,

Instytut Zootechniki,

32-083 Balice k. Krakowa.

1. Wprowadzenie

Zwierzêta transgeniczne uzyskuje siê obecnie poprzez prze-

niesienie do dróg rodnych hormonalnie przygotowanych bior-

czyñ, zarodków uzyskanych przy u¿yciu nastêpuj¹cych technik:

– bezpoœredniej mikroiniekcji genu lub fragmentu DNA do

mêskiego przedj¹drza zygoty;

1 (72) 29–43 2006

Joanna Jurkiewicz

– modyfikacjê genetyczn¹ pierwotnych komórek zarodkowych – ESC (ang. em-

bryonic stem cells ) i wprowadzenie ich do zarodka w stadium blastocysty;

– infekcjê wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wiru-

sowego;

– klonowanie somatyczne z zastosowaniem transfekowanych linii komórkowych.

Spoœród tych metod najszerzej stosowana jest mikroiniekcja egzogennego DNA

do mêskiego przedj¹drza zygoty (zob. Jura i wsp. w tym samym numerze). Efektyw-

noœæ metody, jak wiadomo, nie jest zadowalaj¹ca, ponadto wymaga u¿ycia kosztow-

nej aparatury (mikromanipulatory, mikroskop odwrócony), oraz du¿ych umiejêtnoœ-

ci operatorów. Z tego wzglêdu rozwijane s¹ badania zmierzaj¹ce do opracowania

alternatywnej dla mikroiniekcji metody. Jedn¹ z takich metod jest transfer genów za

poœrednictwem plemników jako noœników (wektorów) egzogennego DNA. Metoda

ta mo¿e byæ korzystna szczególnie dla tych gatunków zwierz¹t, u których efektyw-

noœæ mikroiniekcji DNA jest szczególnie niska, a koszty uzyskania zygot wysokie,

jak np. u byd³a. Najkorzystniejszym aspektem wykorzystania plemników jako wek-

torów egzogennego DNA jest mo¿liwoœæ uzyskiwania transgenezy na szerok¹ skalê

produkcyjn¹. Odmiennie ni¿ mikroiniekcja, któr¹ nale¿y przeprowadzaæ na ka¿dej

pojedynczej zygocie, u¿ycie plemników jako wektorów mo¿e prowadziæ do uzyska-

nia du¿ej liczby zmodyfikowanych zarodków.

2. Metody wprowadzania DNA do plemników

U¿ycie plemników jako wektorów do przenoszenia sekwencji egzogennego DNA

do oocytu podczas procesu zap³odnienia jest, jak siê wydaje, prost¹ i ³atw¹ metod¹

uzyskiwania zwierz¹t transgenicznych. W metodzie tej wykorzystuje siê zdolnoœæ

wi¹zania egzogennego DNA przez plemniki. Egzogenne DNA mo¿e byæ wprowadza-

ne do komórek plemników przy wykorzystaniu kilku metod. Najbardziej rozpo-

wszechniona metoda polega na bezpoœredniej inkubacji pozbawionych osocza plem-

ników, z egzogennym DNA. Inkubacja przeprowadzana jest przy odpowiednio do-

branych parametrach temperatury i czasu jej trwania. Uzyskane w rezultacie plemni-

ki, przenosz¹ce obc¹ informacjê genetyczn¹ wykorzystywane s¹ do zap³odnienia in

vitro , inseminacji standardowej lub laparoskopowej. We wstêpnych badaniach wyka-

zano jednak nisk¹ skutecznoœæ tej metody (8). Aby zwiêkszyæ efektywnoœæ pobrania

i w³¹czenia egzogennego DNA przez plemniki proponowano ró¿ne metody trans-

fekcji plemników, przy u¿yciu elektroporacji, lipofekcji, enzymu restrykcyjnego, czy

przeciwcia³a monoklonalnego (mAb C). Ostatnio zaproponowano nowe rozwi¹za-

nie, w którym inkubowane z DNA plemniki wprowadzano drog¹ mikroiniekcji do cy-

toplazmy oocytu (ICSI).

Inn¹ alternatywn¹ metod¹ w której wykorzystuje siê plemniki jako wektory DNA pole-

ga na mikroiniekcji obcego DNA bezpoœrednio do kanalików nasiennych lub sieci j¹dra.

Plemniki te wykorzystywane s¹ nastêpnie do naturalnego krycia lub inseminacji (3,4).

PRACE PRZEGL¥DOWE

Plemniki jako wektory DNA w uzyskiwaniu zwierz¹t transgenicznych

2.1. Inkubacja plemników z DNA

Pierwsze dowody na mo¿liwoœæ wi¹zania egzogennego DNA przez plemniki ssa-

ków przedstawili Bracket i wsp. w 1971 r. (5). W tym pionierskim doœwiadczeniu wyka-

zano, ¿e plemniki królika, pozbawione osocza, mog¹ wi¹zaæ egzogenny DNA pocho-

dz¹cy od wirusa SV40 i przekazywaæ go w trakcie zap³odnienia do oocytów, powo-

duj¹c ich transformacjê. Obecnoœæ wirusowego DNA w zarodkach zosta³a stwierdzona

dziêki cytotoksycznemu dzia³aniu powodowanemu przez zarodki w stadium 1- i 2-ko-

mórkowym na wspó³hodowane komórki CV1. Wówczas informacja ta zosta³a jednak

zignorowana. Dopiero w roku 1989 znaleziono potwierdzenie w dwóch innych do-

œwiadczeniach, gdzie stwierdzono wi¹zanie egzogennego DNA w komórkach plemni-

ków je¿owca (6) i myszy (7). Arezzo i wsp. (6) wykazali, ¿e zarówno homologiczne jak

i heterologiczne DNA przy³¹cza³o siê do plemników, a w zarodkach stwierdzono eks-

presjê transgenu. Lavitrano i wsp. (7) donieœli, ¿e plemniki naj¹drzowe myszy by³y

spontanicznie zdolne do wi¹zania DNA plazmidu pSV2CAT. Nastêpnie cz¹steczki DNA

zosta³y przekazane do oocytów podczas zap³odnienia, tworz¹c genetycznie zmodyfi-

kowane zarodki. Ekspresjê genu reporterowego CAT stwierdzono w tkankach zwie-

rz¹t pozytywnych, a transgen by³ przekazywany od za³o¿ycieli do potomstwa pokole-

nia F1 w proporcjach zgodnych z rozk³adem mendlowskim. PóŸniej jednak pojawi³o

siê wiele kontrowersji, gdy¿ licznym badaczom nie uda³o siê powtórzyæ tych doœwiad-

czeñ z pozytywnym skutkiem. Negatywne rezultaty zosta³y zbiorczo opublikowane

przez Brinstera i wsp. (8), którym nie uda³o siê uzyskaæ osobników transgenicznych za

poœrednictwem plemników jako noœników egzogennego DNA. Sceptycyzm w odnie-

sieniu do tej metody nie zrazi³ innych eksperymentatorów i nadal podejmowano pró-

by, skupiaj¹c siê przede wszystkim na ocenie zdolnoœci plemników do przy³¹czania

egzogennego DNA. Stwierdzono, ¿e plemniki praktycznie wszystkich gatunków wyka-

zuj¹ zdolnoœæ wi¹zania egzogennego DNA. Wi¹zanie to nie jest przypadkowe, zacho-

dzi zawsze w postakrosomalnym odcinku g³ówki plemnika. Interakcja jest jonowa, od-

wracalna, niezale¿na od sekwencji, i nie ogranicza siê do DNA, ale mo¿e byæ odtworzo-

na przy u¿yciu innych, ujemnie na³adowanych makrocz¹steczek (9).

Wnioski te wysuniêto na podstawie licznych doœwiadczeñ, w których przebada-

no wiele gatunków zwierz¹t, od owadów do ssaków.

Atkinson i wsp. (10) opisali wi¹zanie egzogennego DNA z plemnikami u muchy

Lucilia cuprina i pszczo³y miodnej Apis mellifera. W tym przypadku liniowy plazmid

DNA zawieraj¹cy fragment genu muszki Drosophila melanogaster vermillon poddano

inkubacji z plemnikami. Okaza³o siê, ¿e cz¹steczki DNA s¹ wi¹zane na ca³ej d³ugoœci

plemników u obydwu owadów. Proces wi¹zania egzogennego DNA z plemnikami

stwierdzono równie¿ u ¿aby szponiastej Xenopus laevis. W tym przypadku wi¹zanie

cz¹steczek DNA nastêpowa³o po prostej inkubacji w temperaturze pokojowej, ju¿

w ci¹gu pierwszych 20 min (11). Podobn¹ w³aœciwoœæ wykazywa³y plemniki ryb:

wi¹zanie egzogennego DNA z plemnikami opisano u karpia (12), ³ososia odmiany

chinook (13) i danio prêgowanego (14).

BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 29-43 2006

Joanna Jurkiewicz

Castro i wsp. (12) przeprowadzili eksperymenty na kilku gatunkach zwierz¹t go-

spodarskich stwierdzaj¹c, ¿e zdolnoœæ przy³¹czania egzogennego DNA wykazuj¹

plemniki koguta, koz³a, tryka, knura i buhaja. Po prostych inkubacjach plemników

wymienionych gatunków zwierz¹t z egzogennym DNA zauwa¿ono znaczne ró¿nice

w stopniu przy³¹czenia jego cz¹steczek. Stwierdzono, ¿e egzogenny DNA przy³¹cza

siê do 7-25% plemników koguta, 1,5-3% buhaja, 6-10% tryka i koz³a, a zaledwie do

0,3% knura. W przeciwieñstwie do tych wyników Camaioni i wsp. (15) uzyskali

znacznie lepsze rezultaty. Po godzinnej inkubacji z pSV2CAT DNA obserwowano

przy³¹czenie DNA do 78% plemników knura, 47% buhaja, a tak¿e do 26% plemników

mê¿czyzny. Natomiast poœrednie wartoœci uzyskali Horan i wsp. (16), gdy po inkuba-

cji plemników z plazmidem p(RSV bGh) DNA stwierdzili przy³¹czanie siê 30% plemni-

ków knura. Zdolnoœæ dojrza³ych plemników do wi¹zania egzogennego DNA zosta³a

równie¿ potwierdzona przez Francolini i wsp. (17), którzy dodatkowo zauwa¿yli, ¿e

pewna czêœæ egzogennego DNA zwi¹zanego z plemnikami jest póŸniej internalizo-

wana do j¹dra i wbudowywana do chromatyny. Efektywnoœæ tego procesu zale¿a³a

od czasu trwania inkubacji. Wyników doœwiadczeñ nie mo¿na jednak bezpoœrednio

porównywaæ, ze wzglêdu na szereg ró¿nic w zastosowanych protoko³ach doty-

cz¹cych postêpowania z plemnikami, a tak¿e ze wzglêdu na ró¿nice miêdzyrasowe.

Lokalizacja rejonów wi¹zania DNA w plemnikach wszystkich badanych gatunków

zwierz¹t by³a wyraŸna w postakrosomowym odcinku g³ówki plemnika. W przypad-

ku plemników mêskich lokalizacja jest podobna jak u innych gatunków, przy czym

znakowany obszar zazwyczaj wychodzi poza ma³y odcinek postakrosomu, zakry-

waj¹c ³¹cz¹cy fragment (15). Natomiast w plemnikach buhaja zauwa¿ono dodatko-

we wi¹zanie cz¹steczek DNA w 2 miejscach: w skrajnie tylnej czêœci koñcówki

g³ówki oraz w obszarze zewnêtrznej czapeczki akrosomalnej. Te 3 miejsca lokaliza-

cji mog¹ istnieæ w obrêbie jednego plemnika (10).

W kolejnych badaniach zmierzano do okreœlenia zjawiska interakcji egzogenne-

go DNA z komórkami plemników jako podstawowej reakcji tego procesu. Okaza³o

siê, ¿e zaskakuj¹co du¿o czynników moduluje interakcje plemników z egzogennym

DNA. Lavitrano i wsp. (9) zidentyfikowali bia³ka o wielkoœci 30-35 kDA wystêpuj¹ce

na powierzchni plemnika, które w specyficzny sposób wi¹¿¹ siê z DNA. Bia³ka te

mog¹ braæ aktywny udzia³ w przy³¹czeniu DNA, jeœli tylko interakcja ta nie jest

wstrzymywana przez czynnik hamuj¹cy (IF-1) wystêpuj¹cy w osoczu. Czynnik ten

zosta³ rozpoznany zarówno w osoczu ssaków jak i na powierzchni plemników u bar-

dziej prymitywnych gatunków, nie posiadaj¹cych osocza (np. u je¿owca) (18). Wi¹¿e

siê on selektywnie z postakrosomowym odcinkiem g³ówki plemników, tzn. z tym

samym odcinkiem komórki, w którym zachodzi wi¹zanie egzogennego DNA. Tak za-

tem IF-1 prawdopodobnie odgrywa istotn¹ rolê dzia³aj¹c jako naturalna bariera

i chroni¹c plemniki naj¹drzowe przed niepo¿¹danym wtargniêciem obcych cz¹ste-

czek, które mog³yby naruszyæ integralnoœæ plemnika i genetyczn¹ to¿samoœæ po-

tomstwa. W obszernej pracy Lavitrano i wsp. (19) rozpoznali dwie inne cz¹steczki,

które byæ mo¿e uczestnicz¹ w internalizacji cz¹steczek DNA: CD4 i g³ówny uk³ad

PRACE PRZEGL¥DOWE

Plemniki jako wektory DNA w uzyskiwaniu zwierz¹t transgenicznych

zgodnoœci tkankowej (MHC) klasy II. Okaza³o siê, ¿e zarówno cz¹steczki CD4 jak

i uk³adu zgodnoœci tkankowej klasy II (MHC II) odgrywaj¹ znacz¹ce, ale odmienne

role w procesie interakcji plemników z egzogennym DNA. Wysuniêto hipotezê, ¿e

podczas spermatogenezy konieczna jest ekspresja MHC klasy II w celu wytworzenia

dojrza³ych komórek plemników, ca³kowicie kompetentnych i zdolnych do absorbo-

wania DNA. Natomiast cz¹steczki CD4 s¹ potrzebne do jego internalizacji w j¹drze.

Zoragi i Spadafora (20) sugeruj¹, ¿e zwi¹zany egzogenny DNA przy³¹cza siê w plem-

nikach do rusztowania j¹drowego, po czym zostaje przegrupowany i podlega re-

kombinacji z genomowym DNA plemnika. Miejsca integracji nie s¹ ze sob¹ po-

wi¹zane, ale s¹ otoczone przez identyczne sekwencje co sugeruje, ¿e integracja na-

stêpuje w preferowanych miejscach. Równolegle do jednego koñca miejsca integra-

cji znajduje siê sekwencja konsensusowa topoizomerazy II, co wskazuje na mo¿liw¹

rolê tego enzymu w procesie rekombinacji niehomologicznej. Natomiast interakcja

plemników naj¹drzowych z egzogennym DNA uruchamia endogenn¹ nukleazê, któ-

ra rozszczepia DNA zarówno egzogenne jak i genomowe prowadz¹c ostatecznie do

procesu œmierci komórkowej przypominaj¹cej proces apoptozy (21-23).

Uzyskane wyniki pozwoli³y na dok³adniejsze i bardziej precyzyjne opracowanie

metody. W kolejnych badaniach, uwzglêdniaj¹cych uzyskane informacje otrzymano

genetycznie zmodyfikowane zarodki i osobniki transgeniczne z potwierdzon¹ eks-

presj¹ wprowadzanego egzogennego DNA (24-34).

W zakrojonym na du¿¹ skalê doœwiadczeniu Maione i wsp. (24) powtórzyli eks-

peryment przeprowadzony przez Lavitrano w 1989 r. (7), uzyskuj¹c transgeniczne

myszy. Plemniki myszy inkubowano z plazmidowym DNA pSV2CAT podczas kapacy-

tacji, dodaj¹c je potem do dojrza³ych komórek jajowych. W tym eksperymencie czê-

stotliwoœæ inkorporacji DNA do plemnika by³a wzglêdnie jednolita – 90%, ale pro-

porcja uzyskanych transgenicznych p³odów by³a zmienna. Na 75 przeprowadzonych

prób tylko w 13 uda³o uzyskaæ siê transgeniczne osobniki. W zale¿noœci od ekspery-

mentu potomstwo okazywa³o siê transgeniczne od 0 do 100%. Okolicznoœci pro-

wadz¹ce do tych zró¿nicowanych wyników pozostaj¹ nie wyjaœnione. U byd³a w wy-

niku zap³odnienia in vitro nasieniem transfekowanym plazmidem pSV2CAT uzyskano

10% genetycznie zmodyfikowanych zarodków. Natomiast po inseminacji takim na-

sieniem uzyskano 1 transgeniczne cielê wykazuj¹ce s³abe specyficzne dla transgenu

sygna³y o niespodziewanej d³ugoœci (25). Sperandio i wsp. (27) inkubowali plemniki

buhaja i knura z 3 ró¿nymi plazmidowymi DNA (pSV2CAT, pRSV, pAGLU). Stwierdzili

przy³¹czenie i przekazanie transgenu podczas zap³odnienia uzyskuj¹c genetycznie

zmodyfikowane zarodki w przypadku obydwu badanych gatunków zwierz¹t. Efek-

tywnoœæ w tym przypadku zale¿na by³a od u¿ytego plazmidu. Najlepsze rezultaty

uzyskano przy wykorzystaniu plazmidu pSV2CAT: 22% transgenicznych bydlêcych

blastocyst, i 5,7% œwiñskich. Po inseminacji 10 loch transfekowanymi plemnikami

uzyskano 5 transgenicznych prosi¹t. W innym doœwiadczeniu przy wykorzystaniu

tego samego plazmidu i jego inkubacji z plemnikami knura równie¿ uda³o siê otrzy-

maæ transgeniczne osobniki. Transgen zlokalizowano w genomie 12 prosi¹t, ale nie

BIOTECHNOLOGIA 1 (72) 29-43 2006

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: