Terapia genowa.docx

Genetyka 5 – terapia genowa

Podstawowym założeniem terapii genowej chorób uwarunkowanych genetycznie jest leczenie przyczyn, a nie objawów, czyli usunięcie lub skorygowanie defektu genetycznego.

1)      Mutacje recesywne

1. 1. Komplementacja defektu genetycznego

2)      Mutacje dominujące

1. 1. Hamowanie ekspresji zmutowanego genu
   2. Korygowanie mutacji

Komplementacja defektu genetycznego

              - wprowadzenie do komórki docelowej kopii prawidłowego genu

              - mutacje recesywne

              - wektory wirusowe (retro wirusy , lentiwirusy)

              - metoda In vivo

              - metoda ex vivo

Strategia In vivo (dostarczenie genów terapeutycznych wprost do organizmu pac jęta – domięśniowo , do guza, systemowo)

Strategia ex vivo (pobranie komórek pac jęta, namnożenie, modyfikacja genetyczna, wprowadzenie do organizmu pacjenta

Niedogodności komplementacji defektu genetycznego:

              - ograniczona wielkość transgenu

              - wydajność transferu genów do komórek docelowych

              - losowa integracja transgenu do genomu gospodarza

              - czas utrzymania się transgenu w komórce

Hamowanie ekspresji zmutowanego genu:

              - tzw. antysensy

              - 20 -30 nukleotydowe cząsteczki DNA , RNA

              - komplementarne do mRNA, sekwencji DNA genu, jego promotora

Naprawa mutacji

              - jest trwała

              - nieznany mechanizm molekularny

                            a) naprawa błędnie sparowanych zasad

                            b) naprawa przez wycinanie nukleotydów

                            c) rekombinacja homologiczna

              - homologiczne podstawienie małych fragmentów (DNA długości 400-800 nukleotydów)

Eliminacja komórek

1.       Komórki nowotworowe

2.       Komórki zainfekowane wirusami np. wirusem HIV

Strategie zabijania komórek

1.       Bezpośrednia – wprowadzenie do komórki nowotworowej genu kodującego toksyczne białko, genu samobójczego lub proapoptotycznego

2.       Pośrednia – pobudzenie układu immunologicznego do swoistego zabijania komórek nowotworowych

3.       Zahamowanie unaczynienia nowotworu

promotory swoisto tkankowo

Promotory nowotworowo-swoiste

Nowe cechy fenotypowe

1.       Geny proangiogenne – leczenie chorób wywołanych niedotlenieniem

2.       Inhibitory angiogenezy – choroby nowotworowe

3.       Geny odporności wielolekowej – terapia cytostatykami

Nośnik trans genów

1.       Wirusowe – TRANSDUKCJA

1. 1. Adenowirusy
   2. Retrowirusy
   3. Lentiwirusy
   4. Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV)
   5. Wirusy opryszczki

2.       Niewirusowe – TRANSFEKCJA

Uzyskiwanie zrekombinowanych wirusów

1.       Wektor wirusowych – pozbawiony genów replikacji i /lub otoczki białkowej

2.       Komórki pakujące

Wektory adenowirusowi

1.       Zalety

1. 1. Wysokie miano
   2. Duża wydajność transdukcji In vivo ex vivo
   3. Transdukcja dzielących się i nie
   4. Wysoki poziom ekspresji trans genu

2.       Wady

1. 1. Silna odpowiedz immunologiczna na białka wirusa
   2. Niemożność wielokrotnego podania
   3. Cytotoksyczność
   4. Krótkotrwała ekspresja transgenu

Wektory retrowirusowe

1.       Zalety

1. 1. Długotrwała ekspresja transgenu (integracja z genomem)

2.       Wady

1. 1. Tylko komórki dzielące się
   2. Możliwość mutacji inercyjnej
   3. Zastosowanie w transdukcji ex vivo

Lentiwirusy

1.       Zalety

1. 1. Transdukcja komórek dzielących  się i nie
   2. Długotrwała ekspresja transgenu

2.       Wady

1. 1. Możliwość mutacji insercyjnych
   2. Trudna konstrukcja i kontrola jakości

AAV

1.       Zalety

1. 1. Mała immunogenność
   2. Wydajna transdukcja komórek dzielących się i nie
   3. Długotrwała ekspresja transgenu

2.       Wady

1. 1. Możliwość mutacji insercyjnych
   2. Trudna konstrukcja i kontrola jakości
   3. Możliwe zanieczyszczenie adenowirusami

Wirus opryszczki

1.Zalety

1. 1. Transdukcja komórek nie dzielących się
   2. Duże trans geny – 15kpz
   3. Neurotripizm

2.Wady

a. Krótkotrwała ekspresja transgenu

b. niskie miano

Techniki niewirusowe

Metody wprowadzania plazmidowego DNA

1. 1. Fizyczne- bezpośrednia iniekcja plazmidowego DNA, elektroporacja, użycie strzelby genowej
   2. Endocytoza DNA połączonego z nośnikiem ( związkiem chemicznym)

Nośniki niewirusowe

1.       Precypitat z fosforanem wapnia

2.       Lipidy i liposomy kationowe

3.       Kationowe polipeptydy

4.       Polimery i kopolimery kationowe

5.       Dendrymery- wysoko cząsteczkowe rozgałęzione struktury

Etapy transfekcji

1.       Osadzenie plazmidowego DNA na nośniku

2.       Podanie do komórki  na drodze endocytozy

3.       Endosomoliza- uwolnienie z pęcherzyka endocytarnego

4.       Ewentualna dysocjacja kompleksu

5.       Wniknięcie do jądra komórkowego

Mukowiscydoza

1.       Choroba autosomalna recesywna

2.       Mutacja genu CFTR (Cystis Fibrosis Transmembrane Regulator)- błonowy kanał chlorkowy

3.       ...