(), Biochemia L, sprawozdanie kinetyka enzymatyczna (ćw A).docx

(49 KB) Pobierz

Laboratorium biochemii

Kinetyka enzymatyczna I (ćw. A)

1. Cel ćwiczenia

ü Wyznaczenie podstawowych parametrów kinetycznych dla kwaśnej fosfatazy poprzez pomiar ilości powstałego produktu,

ü Ustalenie czy kwaśna fosfataza stosuje się do kinetyki Michaelis’a-Menten,

ü Obliczenie stałej Michaelis’a, szybkości maksymalnej oraz stałej szybkości reakcji.

2. Odczynniki

ü 0.25 M bufor octanowy o pH. 5.0

ü 0.5 M wodorotlenek sodu

ü 5 mM roztwór standardowy p-nitrofenolu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

ü 5 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

ü Roztwór fosfatazy kwaśnej z ziemniaka w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0,

Ce° = 0.08 mg/ml

3. Szkło i aparatura

ü probówki chemiczne

ü kolba ad 10 ml

ü pipety automatyczne oraz tipsy

ü kuwety

ü Specol

ü termostat nastawiony na 37°C

4. Wykonanie ćwiczenia

1. Pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu:

a) Do 21 probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 1:

· 0.25 M buforu octanowego o pH 5.0

· 5.0 mM p-nitrofenylofosforan,

b) Roztwory inkubowano przez 5 min w łaźni wodnej o temperaturze 37°C,

c) Po czasie inkubacji do nieprimowanych probówek dodano roztwór fosfatazy,

d) Próby 1-11 inkubowano w 37°C przez 25 min.,

e) Po upływie czasu do wszystkich próbek dodano po 2 ml 0.5M roztworu NaOH,

f) Zmierzono absorbancję roztworów przy λ=410 nm względem próby 11.

2. Krzywa standardowa

a) Otrzymany roztwór p-nitrofenolu rozcieńczono 50-krotnie w kolbie miarowej o pojemności 10 ml. Otrzymany roztwór dokładnie wymieszano i przelano do

probówki „P”,

b) Do 8 suchych probówek dodano w ilościach zadanych w Tabeli 2. :

· 0.25 M bufor octanowy o pH 5.0,

· 0.1mM p-nitrofenol,

· 0.5 M NaOH

c) Zmierzono absorbancję przy λ=410 nm dla sporządzonych roztworów wobec odnośnika – próbki 8.

5. Obliczenia i wyniki