koniugacja.pdf

Koniugacja bakterii

Koniugacja – sposób przekazywania materiału genetycznego u bakterii z

komórki dawcy do komórki biorcy

obecność autonomicznego od chromosomu plazmidu

koniugacyjnego

Szczep F- ® bez plazmidu płciowego F

Szczep Hfr ® szczepy, w których plazmid F został wbudowany w chromosom,

od miejsca wbudowania zaleŜy jaki typ Hfr powstanie

Plazmid F

- niesie geny, które decydują o inicjacji i regulacji jego własnej replikacji ¥

geny rep

- ma 30% genów tra (transferowe – przekazywanie plazmidu innym komórkom)

- nadaje komórce cechy dawcy, kodowane przez geny tra –

Geny tra: - wytwarzanie pilusów płciowych

- wraŜliwość na fagi tzw. męskie (tj. atakujące komórki mające

plazmid F)

- pękanie plazmidu w ori t

- przekazywanie plazmidu do komórki biorcy

IS – sekwencje na plazmidzie odpowiadające za wbudowywanie plazmidu do

chromosomu; włączanie moŜe nastąpić w wielu miejscach

Koniugacja

Rekombinanty – do biorcy przekazywane są markery chromosomalne

Dawca E.coli – HfrC Str s (wraŜliwy na streptomycynę)

Biorca E.coli F - - pro met thy Str r (oporny na streptomycynę)

Spodziewamy się rekombinantów:

1. pro+ Str r (markery proliny połoŜene bliŜej oriT – więcej rekombinantów)

2. met+ Str r

3. thy+ Str r ale taki prawdopodobnie nie powstanie ze względu na duŜą

odległość połoŜenia genu kodującego wytwarzanie thy od oriT

Otrzymaliśmy rekombinanty:

1 i 2

Szczepy F+

KrzyŜówka 1 – przekazywanie zdolności do syntetyzowania

aminokwasów u auksotrofów

By wykryć które otrzymaliśmy musimy zastosować podłoŜa selekcyjne na

których wyrosną tylko bakterie, które uległy koniugacji – rekombinanty

Ad 1 Davis + metionina + tymina + Str

Ad 2 Davis + prolina + tymina + Str

Transkoniuganty – do biorcy przekazyany jest cały plazmid

Dawca E.coli DH1 – niosąca plazmid pR6k Amp r (ampicylino oporny)

Biorca E.coli MC1061 Rif r (rifampicylino oporny)

Obliczanie częstości rekombinacji:

1. wysiewamy próbę kontroną – dawca – to samo stęŜenie co uŜyte do koniugacji –

liczymy kolonie

2. liczymy kolonie rekombinantów na podłoŜu selekcyjnym

3. obliczamy ilość dawcy i rekombinantów na 1 ml

4. podstawiamy do wzoru:

x = a /b x 100%

a – liczba rekombinantów w 1 ml mieszaniny koniugacyjnej

b – liczba dawców w 1 ml mieszaniny koniugacyjnej

Izolujemy transkoniugant

1. E.coli MC1061 Rif r Amp r

Stosujemy podłoŜe selekcyjne

Ad 1 agar odŜywczy z Amp i Rif (więcej niŜ 2 antybiotyki nie są nigdy

dodawane do podłoŜa, bo mimo iŜ bakteria jest na nie oporna to nie daje rady

wyrosnąć – duŜy stres)

Przygotowanie kolonii do koniugacji:

1.Zakładamy hodowlę 18h na podłoŜu Davisa uzupełnionym wymaganymi

przez dany szczep czynnikami wzrostowymi

2.Nocną hodowlę rozcieńczmy 1:20 (tak by kaŜdy dawca odnalazł biorcę)

3.Inkubujemy w 37 st. 2,5h – do osiągnięcia fazy wzrostu logarytmicznego

Mapowanie genów na chromosomie

Mapę genową plazmidu moŜemy ustalić na podstawie częstości rekombinacji

RóŜne podłoŜa selekcyjne – badanie ilości rekombinantów w kolejnych

minutach (dawca zabity w min 0 przez dodanie antybiotyku)

Nagły przyrost rekombinantów w danej minucie na wykresie – połoŜenie genu

na plazmidzie

KrzyŜówka 2 – otrzymywanie bakterii opornej na oba antybiotyki

Gen proksymalny – tuŜ za Ori T np. prolina – dla tych genów jest inna metoda –

analizy sprzęŜeń

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: