Urszula Marchewka Biotechnologia gr 3
Detektory masowe
Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych
mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu
chromatograficznego.Fazą ruchomą może być gaz, ciecz lub płyn w stanie nadkrytycznym, a fazą nieruchomą (stacjonarną) ciało stałe lub ciecz.
Chromatografia, początkowo niedoceniana, należy obecnie do najbardziej rozpowszechnionych metod instrumentalnych w chemii analitycznej, a w analizie związków organicznych zajmuje pozycję lidera (minimum 100 000 związków organicznych). Znanych jest wiele jej wariantów, a bardzo istotne jest to, iż jako nieliczna metoda, umożliwia uzyskanie wyników jakościowych i ilościowych dla wielu oznaczanych substancji w jednym cyklu pomiarowym, nawet przy niskich stężeniach i w obecności innych związków.
Klasyfikacji metod chromatograficznych można dokonać według kilku kryteriów. Jednym z nich jest:
a) Stan skupienia fazy ruchomej
W ten sposób wyróżnić można chromatografię:
-gazową (ang. gas chromatography, GC),
-cieczową (ang. liquid chromatography, LC),
-w fazie nadkrytycznej (ang. supercritical fluid chromatography, SFC).
b) Stan skupienia fazy stacjonarnej. Fazą stacjonarną może być ciecz na nośniku lub ciało stałe. Stąd otrzymujemy następujące układy chromatograficzne:
Faza ruchoma faza stacjonarna
-gaz ciecz (ang. gas-liquid chromatography, GLC)
-ciecz ciecz (ang. liquid-liquid chromatography, LLC)
-gaz ciało stałe (ang. gas-solid chromatography, GSC)
-ciecz ciało stałe (ang. liquid-solid chromatography, LSC).
Ciało stałe może mieć różny charakter (być adsorbentem, nośnikiem modyfikatora
chemicznego, wymieniaczem jonowym lub sitem molekularnym). Wynikają z tego nowe podziały związane z naturą zjawisk stanowiących podstawę procesu chromatograficznego.
c) Natura zjawisk będących podstawą procesu chromatograficznego
Chromatografię dzielimy na :
-adsorpcyjną, w której rozdzielanie odbywa się w wyniku różnego powinowactwa
adsorpcyjnego składników mieszaniny do odpowiednio dobranej powierzchni fazy
stacjonarnej, zwanej adsorbentem,
-podziałową, w której rozdzielanie związane jest z różnymi wartościami współczynnika podziału składników mieszaniny między dwie nie mieszające się fazy, z których jedną jest faza stacjonarna (ciecz na nośniku), a drugą faza ruchoma (gaz, ciecz lub płyn wstanie nadkrytycznym),
-jonowymienną, w której podstawą rozdzielania są różnice w sile oddziaływań
międzycząsteczkowych pomiędzy jonami z roztworu a jonami związanymi z fazą
stacjonarną (zwaną jonitem).
-sitową, zwaną inaczej chromatografią żelową, sączeniem molekularnym lub
chromatografią wykluczania, w której o rozdzielaniu składników mieszaniny decydują
rozmiary cząsteczek.
d) Techniki eksperymentalne
Proces chromatografowania prowadzić można techniką:
-kolumnową, stosowaną we wszystkich metodach chromatograficznych,
-planarną, możliwą jedynie w chromatografii cieczowej, którą podzielić można
dodatkowo na chromatografię bibułową i cienkowarstwową.
W zależności od celu przeprowadzanej analizy, wymienione techniki eksperymentalne można dodatkowo podzielić na: analityczne (identyfikacja analitów, „mała” ilość próbki) i preparatywne (wyodrębnianie poszczególnych składników).
Na Rys. przedstawiono ideę rozdzielania chromatograficznego mieszaniny składającej się z dwóch składników: A i B.
Mieszaninę tę wprowadzono do fazy ruchomej w czasie, który przyjęto
za zerowy i od którego rozpoczął się proces rozdzielania składników w wyniku różnego sposobu ich oddziaływania z fazą ruchomą i nieruchomą. Załóżmy, ze składnik A oddziałuje z fazą nieruchomą znacznie słabiej niż składnik B. Cząsteczki obu substancji dzielą się między obie fazy w różnych stosunkach, charakterystycznych dla tych składników i opisanych przez stałe podziału
Dla składnika A
Dla składnika B
W obu przypadkach c oznacza stężenie składnika w fazie nieruchomej (s) i w fazie ruchomej (m).
Między liczbą cząsteczek związków chromatografowanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej, ustala się równowaga dynamiczna z wielokrotnym przechodzeniem tych cząsteczek z jednej fazy do drugiej. Ich przenoszenie wzdłuż układu chromatograficznego jest możliwe tylko wtedy, gdy znajdują się w fazie ruchomej. W czasie t1 widoczny jest różny podział składników między obie fazy układu chromatograficznego i rozdzielenie tych składników. To rozdzielenie jest możliwe tylko wtedy, gdy stałe podziału tych składników różnią się.
Z Rys. wynika, że w czasie t2 jeden ze składników (A) został już wyniesiony z układu
chromatograficznego i znajduje się w fazie ruchomej, a w czasie t3 oba składniki (A i B) są już w fazie ruchomej poza zasięgiem oddziaływania fazy stacjonarnej. Pasma stężeniowe składników po przejściu układu chromatograficznego różnią się od pasma początkowego mieszaniny. Różnica polega na poszerzeniu tych pasm i na przyjęciu kształtu krzywej Gaussa. Pasma te noszą nazwę pików chromatograficznych. Na Rys. widać, że pik składnika B jest szerszy niż pik składnika A. Jest on wynikiem większego rozmycia dyfuzyjnego składnika B, który dłużej przebywał w układzie chromatograficznym.
Całkowitym czasem retencji tR nazywamy czas jaki upływa między wprowadzeniem
próbki a pojawieniem się maksimum piku rozpatrywanego składnika próbki. Całkowity czas retencji jest sumą czasu, w którym substancja oddziałuje z wypełnieniem kolumny i czasu potrzebnego do przejścia tej substancji od dozownika do detektora, gdyby takiego oddziaływania nie było.
Składnik niezatrzymywany przez fazę stacjonarną pojawia się w wycieku po czasie tM, nazywanym czasem retencji substancji niezatrzymywanej lub zerowym czasem retencji. Czas retencji substancji niezatrzymywanej można łatwo wyznaczyć przez zadozowanie do kolumny substancji, która nie oddziałuje z fazą stacjonarną lub oddziałuje z nią bardzo słabo.
Czas retencji związany z przebywaniem substancji w kolumnie tylko w wyniku oddziaływania tej substancji z wypełnieniem kolumny nazywany jest zredukowanym czasem retencji.
W niektórych przypadkach korzystne jest posługiwanie się objętościami retencji. Otrzymuje się je, mnożąc czas retencji [min] przez objętościowe natężenie przepływu fazy ruchomej (Fc)
[ml/min]:
całkowita objętość retencji VR = tR· Fc ,
objętość retencji substancji niezatrzymywanej VM = tM · Fc ,
zredukowana objętość retencji V’R = t’R ·Fc .
Objętość retencji jest wielkością, która w odróżnieniu od czasu retencji nie zależy od
liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej u [cm/min]. Współczynnik retencji k, jest to stosunek ilości substancji w fazie stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej. Jeśli cS i cM oznaczają odpowiednio równowagowe stężenia substancji (wyrażone w molach) w fazie stacjonarnej i ruchomej a VS i VM są objętościami tych faz w kolumnie, to
Wielkość K=Cs/Cm nazywa się stałą podziału substancji między dwie fazy.
Współczynnik retencji k można łatwo obliczyć, wykorzystując zmierzone wartości retencji:
k = (tR - tM) / tM = t’R / tM = (VR – VM) / VM = V’R / VM
Im większa jest wartość współczynnika retencji, tym silniej substancja oddziałuje z
wypełnieniem kolumny. Z powyższej zależności wynika, że:
tR =t M (1+k) , natomiast VR = VM ( 1 + k)
Moc fazy ruchomej powinna być tak dobrana, aby wartości k znalazły się w przedziale 0,5-10. Gdy oznaczany składnik występuje w małym stężeniu, należy, jeśli to możliwe, ustalić dla niego wartość k nieco poniżej 1 (uzyskujemy wówczas maksymalną czułość). Jeśli k > 10 wydłuża się czas analizy, a nie polepsza się stopień rozdzielenia.
Wielkość, którą można łatwo wyznaczyć, a która zależy od rodzaju rozdzielanych substancji i rodzaju fazy ruchomej jest retencja względna (r). Określa się ją jako stosunek retencji dwóch substancji chromatografowanych, z których jedna jest wzorcem (st), a retencja drugiej (i) jest zbliżona do retencji wzorca:
r = t’Ri / t’Rst = ki / kst
Wartość r może być większa lub mniejsza od 1. Im bardziej r jest różne od 1, tym lepiej dwie substancje rozdzielają się.
Współczynnik rozdzielania (zwany także współczynnikiem selektywności) jest miarą
rozdzielenia dwóch sąsiednich pików na chromatogramie, dla których t’R2 > t’R1:
Współczynnik rozdzielania ma zawsze wartość większą od 1.
Sprawność kolumn chromatograficznych charakteryzuje się wysokością półek H, tzn. najmniejszą długością odcinka kolumny, w której osiąga się stan równowagi między stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej. Wysokość półki zdefiniowana jest za pomocą wzoru:
H=L/N
gdzie: N - liczba półek, L – długość kolumny.
Im wartość H jest mniejsza, tym kolumna ma więcej półek i jest sprawniejsza (przy optymalnej prędkości fazy ruchomej wartość H mieści się w przedziale 0,015–0,02 mm).
Zależność między liczbą półek i długością ko...
umi