Biotechnologia - Kolokwium 2.doc

Biotechnologia – ćwiczenia 2010/2011

Kolokwium 2. Magdalena Pawełkiewicz                                                                                                              30.11.2010 r.

Transformacja – (definicja mikrobiologiczna wg Griffitha 1929) zmiana fenotypu organizmu przez wprowadzenie obcego DNA do jego genomu;

- zmiana genetycznych właściwości komórki (organizmu) spowodowana pobraniem DNA wyizolowanego z innej komórki i włączeniem go do aparatu genetycznego

Metody transformacji:

Ø      bezwektorowe:

§         - elektroporacja (transformacja protoplastów)

§         - PEG (transformacja protoplastów)

§         - mikrowstrzeliwanie

§         - mikroinekcja

§         - wytrząsanie zawiesiny komórek z włóknami szklanymi

§         - wprowadzanie DNA zamkniętego w liposomach

Ø      wektorowe:

§         - Agrobacterium tumefaciens

§         - Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium tumefaciens:

·         Gramm (-), wolnożyjąca bakteria glebowa nalężąca do rodziny Rhizobiaceae

·         Polifag

·         Wywołuje chorobę określaną jako rak szyjki korzeniowej (crown gall disease)

·         Infekuje rośliny dwuliścienne oraz kilka roślin jednoliściennych np. Asparagus officinalis, Z. mays, T. aestivum

·         Plazmid Ti (tumor inducing plasmid) zawierający fragment T-DNA

Agrobacterium rhizogenes:

·         Gramm (-), wolnożyjąca bakteria glebowa nalężąca do rodziny Rhizobiaceae

·         Wywołuje chorobę przerostów korzeniowych - włośnikowatość

·         Plazmid Ri (Rootinducing plasmid) zawierający fragment T-DNA

Plazmid Ti:

·         Plazmid indukujący tumory (ang. Tumor inducing plasmid)

·         Wlk. Ok. 200 kpz

·         Występuje w komórce w małej liczbie kopi (1-2)

·         Replikuje niezależnie od chromosomu bakteryjnego

·         Może być przenoszony między komórkami Agrobacterium na drodze koniugacji

T-DNA:

·         Obszar przenoszony do komórek roślinnych w postaci ssDNA

·         Wyznaczony przez specyficzne 25 nukleotydowe sekwencje graniczne (RB-right border, LB-left border)

·         Geny obszaru T-DNA nie ulegają ekspresji w komórkach Agrobacterium

W obszarze T-DNA znajdują się:

·         Geny syntezy opin

·         Geny syntezy hormonów roślinnych (auksyn i cytokinin)

Opiny – pochodne aminokwasów głównie argininy, żródło C i N dla bakterii; 3 klasy opin: -oktopina, - nopalina, -agropina

Onkogeny – geny syntezy fitohormonów:

Ø      Auksyn

·         IaaM (monooksygenaza tryptofanu)

·         IaaH (hydrolaza indoloacetamidowa)

Ø      Cytokinin

·         ipt (transferaza izopentylowa)

Transfer T-DNA:

1.      Przyczepienie się Agrobacterium do komórek roślinnych

- geny chromosomalne: chvA, chvB, pscA, att

Zranione komórki produkują związki fenolowe chemoatraktanty – np. Acetosyringon (stymulacja genów vir)

2.      Przeniesienie T-DNA do komórki roślinnej

- geny wirulencji (vir; 24 geny zgrupowane w 8-u operonach: A, B, C, D, E, F, G, H)

Model przeniesienia i integracji T-DNA

·         Nić T przenoszona jest w postaci kompleksu DNA-białko

·         Białko na końcu 5’ T-DNA wchodzi w interakcję z roślinnym DNA i nacina je

·         Jednoniciowe T-DNA jest przyłączane do jednej nici DNA a powstałe napięcia rozrywają drugą nić

·         Końce nici T ligowane z DNA i dosyntetyzowana jest 2 nić komplementarna do nici T

·         Często dochodzi do rearanżacji w obszarze

Wprowadzenie DNA do komórki Agrobacterium

·         Klonowanie i modyfikowanie DNA dokonuje się w plazmidach E.coli

·         Plazmid ze skonstruowanym genem jest przenoszony do Agrobacterium za pomocą:

- koniugacji

- rekombinacji homologicznej

Konstrukcja integrowanego DNA

·         Organizacja i orientacja sekwencji DNA (transgenu), która ma być wprowadzona do genomu roślinnego, zależy od tego jakich zmian oczekuje się w roślinie transgenicznej np.: nadekspresja, represja, tkankowo- swoista ekspresja, ekspresja regulowana warunkami środowiska

·         Sekwencja DNA musi mieć odpowiednią organizację sekwencji kodującej i regulatorowej

·         Konstrukcje zawierają fragmenty genów różnych organizmów i tworzy się je poprzez cięcie specyficznymi enzymami restrykcyjnymi i ligację

Budowa konstrukcji genomowej

·         Promotory – sekwencje DNA nieodczytywane, sygnalizujące gdzie trzeba zacząc odczytywanie kodu DNA. Do nich przyłącza się bardzo ważne białko enzymatyczne – polimeraza RNA. To właśnie ono dokonuje syntezy mRNA. Konstytutywne, tkankowo specyficzne, indukowane: chemiczne określonymi warunkami środowiskowymi

·         Terminatory – sekwencje DNA nieodczytywane, które dają znak polimerazie RNA w którym miejscu ma zakończyć transkrypcję

Agrobacterium tumefaciens – narzędzie inżynierii genetycznej

Opracowano metody wprowadzenia dowolnego genu do obszaru T-DNA A.tumefaciens, tak aby gen został wprowadzony do komórek roślinnych.

Aby obce geny wprowadzić do obszaru T-DNA należało przekonstruować plazmid Ti.

Analiza procesu integracji T-DNA i wiele innych eksperymentów pozwoliły ostatecznie opracować konstrukcję dwóch wektorów:

·         Kointergarcyjnego – sekwencje wprowadzane do genomu roślin są na samym plazmidzie co geny vir (czyli jest to plazmid Ti po rekombinacji z plazmidem pośrednim)

·         Binarnego – sekwencje wprowadzane genomu roślin i geny vir są na różnych plazmidach (A.tumefaciens posiada rozbrojony plazmid Ti z obszarem wirulencji i plazmid binarny z obszarem T-DNA)

Przygotowanie pożywek

Dla bakterii

Dla roślin

·         Regeneracyjne

·         Selekcyjne z antybiotykami

·         Antybiotyki są wrażliwe na wysoką temperaturę i dodajemy je do pożywki po sterylizacji – antybiotyki sterylizuje się przez filtrowanie

Otrzymanie roślin do transformacji

·         Sterylizacja i wysiew nasion

- dla każdego materiału roślinnego należy dobrać najbardziej właściwe warunki sterylizacji rodzaj, stężenie, czas działania subst sterylizującej. Kompromis: sterylność a uszkodzenie

·         Podchloryn – w celu zapewnienia lepszej penetracji czynnika sterylizującego:

- moczenie w alkoholu etylowym; dodanie detergentu

Kiełkowanie

·         Nasiona po sterylizacji są umieszczane w płytkach Petriego lub słoikach na pożywkach umożliwiających ukorzenienie się tych roślin

·         Wzrost siewek i roślin w kontrolowanych warunkach w fitotronie

Prekultura (kondycjonowanie)

·         Kompetencjędo regeneracji i transformacji można zwiększyć w wyniku prekultury na pożywkach.

·         Przez co stres spowodowany uszkodzeniem tkanek nie nakłada się na stres wynikający z kokultury.

·         Nie zawsze jest korzystne.

Cięcie eksplantatów

·         Eksplantaty = materiał roślinny, z którego inicjowana jest kultura.

·         Najczęściej są to fragmenty jakiegoś organu.

·         Eksplantaty są pobierane z liści i fragmentowane na kawałki o wielkości ok. 5x5 mm.

·         Cięcie może odbywać się na szalce w cienkiej warstwie pożywki MS.

Przygotowanie Agrobacterium

·         Przeprowadzamy pasaż na płytkach z pożywką YEB i prowadzimy hodowlę w 28oC.

·         Po 2 dniach zakładamy płynną kulturę bakterii.

·         Wirujemy bakterie.

·         Osad bakterii rozpuszczamy w pożywce do inokulacji, którą zalejemy przygotowane i pocięte eksplantaty.

·         Inokulum z bakteriami musi mieć odpowiednią gęstość.

Inokulacja – kokultura

·         Eksplantaty zalewa się przygotowaną pożywką z bakteriami.

·         Czas i zagęszczenie?

·         Do zranionych krawędzi „przyczepia” się Agrobacterium i następuje transfer T-DNA do możliwie dużej liczby komórek.

·         Im dłuższy czas kokultury tym trudniej wyeliminować bakterie i dłużej trwa stres rośliny.

·         Inokulacja i kokultura wzmacniają procesy stresowe eksplantatu.

Elimanacja Agrobacterium

·         Po stresie kokultury bakterie powinny zostać jak najszybciej wyeleminowane (potencjał regeneracyjny).

·         Stosuje się płukanie eksplantatów w antybiotyku i dodawanie go do pożywki regeneracyjnej.

·         Skuteczne stężenia antybiotyków nie są neutralne dla tkanek roślinnych.

·         Mimo podawania antybiotyków w kolejnych pasażach, bakterie mogą przetrwać przez cały okres kultury.

Wykładanie eksplantatów na pożywki regeneracyjne i selekcyjne

·         Stosowanie czynnika selekcyjnego zaraz po zakończeniu kokultury może zahamować regenerację.

·         Selekcja powinna:

- wyeliminować lub osłabić komórki, które nie uległy transformacji

- komórki transgeniczne mają aktywne geny

·         I nie powinny negatywnie reagować na antybiotyk ,

·         Wybór strategii selekcji zależy od promotora i genu markerowego, reakcji tkanek i sposobu regeneracji.

Regeneracja roślin

·         Po 2-3 tygodniach pojawia się kalus na eksplantatach w miejscu zranienia

·         Po 6 tygodniach pojawiają się pędy, które są odcinane od kalusa

Ukorzenianie

·         Po zregenerowaniu pędów rośliny są gotowe do ukorzeniania i przekłada się je na pożywki do ukorzeniania po 9 tygodniach

...