Technika histochemiczna.pdf

Spis tre Ś ci:

Mikroskopy ś wietlne - 7

2. Mikroskopy elektronowe - 23

3. –

Przygotowanie materiału do bada ń w mikroskopie elektronowym - 69

5. Technika mro ż eniowa - 88

Podstawy cytochemii i histochemii - 100

Podstawy immunohistochemii - 121

8. Hybrydocytochemia (hybrydyzacja IN SITU ) - 142

–

10. Hodowla komórek i tkanek - 164

11.

Analiza ilo ś ciowa preparatów mikroskopowych - 176

1. MIKROSKOPY Ś WIETLNE

Mikroskopy ś wietlne (optyczne) wykorzystuj ą widzialne pasmo fal elektromagnetycznych i

umo ż liwiaj ą uzyskiwanie powi ę ksze ń rz ę du 10-1500 ×.

1.1. Budowa mikroskopu ś wietlnego

W skład ka ż dego mikroskopu ś wietlnego wchodz ą dwa zespoły cz ęś ci: zespół mechaniczny i

zespół optyczny.

1.1.1. Zespół mechaniczny

Zespół mechaniczny zbudowany jest z nast ę puj ą cych elementów:

• podstawa mikroskopu , z reguły masywna, zapewniaj ą ca jego stabilno ść ;

• statyw , do którego przymocowany jest stolik przedmiotowy i tubus (p. dalej);

• stolik przedmiotowy , posiadaj ą cy w ś rodku okr ą gły otwór dla przej ś cia wi ą zki promieni

ś wietlnych. Stolik wyposa ż ony jest w poruszane współosiowymi pokr ę tłami prowadnice,

umo ż liwiaj ą ce przesuwanie preparatu w dwóch prostopadłych do siebie kierunkach. Dodatkowa

kalibracja (na prowadnicach lub pokr ę tłach) pozwala na liczbowe okre ś lenie współrz ę dnych

dowolnego miejsca w preparacie i szybkie odszukanie go przy powtórnym ogl ą daniu;

• tubus , na którego przeciwległych ko ń cach zamocowane s ą podstawowe elementy optyczne

tworz ą ce obraz: okular i obiektyw. We współczesnych mikroskopach stosuje si ę tzw. tubus

łamany, w którym osie optyczne obiektywu i okularu tworz ą ze sob ą pewien k ą t, co umo ż liwia

wygodne mikroskopowanie;

• rewolwer - obrotowa tarcza znajduj ą ca si ę na dolnym ko ń cu tubusa, do której wkr ę ca si ę 3-6

obiektywów. Dzi ę ki obecno ś ci mechanizmu zatrzaskowego umo ż liwia szybkie ustawienie

po żą danego obiektywu w osi optycznej (zmian ę powi ę ksze ń );

• ś ruba makrometryczna i mikrometryczna . Precyzyjne ustawienie ostro ś ci obrazu wymaga

regulacji odległo ś ci pomi ę dzy preparatem a obiektywem, czyli pomi ę dzy stolikiem

przedmiotowym a tubusem. W zale ż no ś ci od konstrukcji mikroskopu elementem ruchomym

mo ż e by ć b ą d ź stolik b ą d ź tubus, a przesuwu dokonuje si ę za po ś rednictwem dwóch zazwyczaj

współosiowych pokr ę teł umieszczonych w statywie mikroskopu: ś ruby makrometrycznej

(szybkiego przesuwu) oraz mikrometrycznej (wolnego przesuwu). W niektórych mikroskopach

stosuje si ę tylko jedno pokr ę tło (wolnego przesuwu).

1.1.2. Zespół optyczny

W skład zespołu optycznego wchodz ą :

• ź ródło ś wiatła . Mikroskopy badawcze posiadaj ą wbudowane w podstaw ę własne ź ródło

ś wiatła ( ż arówk ę halogenow ą lub ksenonow ą ) o regulowanej jaskrawo ś ci ś wiecenia,

wyposa ż one w przesłon ę . Mikroskopy szkolne wyposa ż one s ą w dwustronne lusterko mog ą ce

obraca ć si ę we wszystkich płaszczyznach. Za jego po ś rednictwem mo ż na korzysta ć z

zewn ę trznych ź ródeł ś wiatła ( ś wiatło dzienne lub lampa);

• filtry . Mikroskopy badawcze wyposa ż one s ą w kilka barwnych filtrów (niebieski, zielony,

ż ółty, czerwony), pomocnych przy kontrastowaniu obrazu mikroskopowego i przy

wykonywaniu mikrofotografii, a tak ż e w filtr ciemny (szary), zmniejszaj ą cy jaskrawo ść obrazu

przy ni ż szych powi ę kszeniach;

• przesłona , umieszczona z reguły przed (pod) kondensorem pozwala na regulacj ę jasno ś ci

pola widzenia i kontrastowo ś ci obrazu;

• kondensor . Jest to układ soczewek skupiaj ą cy wi ą zk ę promieni ś wietlnych wysyłanych ze

ź ródła ś wiatła, w celu o ś wietlenia pola widzenia w preparacie. Apertura numeryczna

kondensora powinna by ć zgodna z apertur ą obiektywu (p. dalej). Kondensor mo ż na przesuwa ć

pionowo za pomoc ą odr ę bnego pokr ę tła, co umo ż liwia regulacj ę o ś wietlenia pola widzenia;

operuj ą c kondensorem i przesłon ą mo ż na ustawi ć optymalne o ś wietlenie preparatu, tzw.

o ś wietlenie Köhlera (w nowoczesnych mikroskopach uzyskuje si ę je automatycznie),

• obiektyw - jeden z dwóch (oprócz okularu) elementów tworzenia obrazu powi ę kszonego. Jest

to układ soczewek dobranych w ten sposób, aby zniwelowa ć wady optyczne pojedynczej

soczewki: aberracj ę sferyczn ą i chromatyczn ą 1 .

W zale ż no ś ci od stopnia i sposobu korekcji tych wad wyró ż nia si ę kilka typów

obiektywów:

- obiektywy monochromatyczne : ze skorygowan ą aberracj ą chromatyczn ą w zakresie

okre ś lonej cz ęś ci widma ś wiatła białego;

- obiektywy achromatyczne : ze skorygowan ą aberracj ą chromatyczn ą w zakresie ś rodkowej

cz ęś ci widma ś wiatła białego;

- obiektywy planachromatyczne : jw., z dodatkowo skorygowan ą aberracj ą sferyczn ą ;

- obiektywy apochromatyczne : ze skorygowan ą aberracj ą chromatyczn ą w zakresie prawie

całego widma ś wiatła białego;

- obiektywy planapochromatyczne : jw., z dodatkowo skorygowan ą aberracj ą sferyczn ą .

Obiektywy planachromatyczne i planapochromatyczne pozwalaj ą na korzystanie z

du ż ego pola widzenia i okularów o znacznych powi ę kszeniach.

Obiektywy mo ż na równie ż podzieli ć na tzw. obiektywy suche (małych i ś rednich

powi ę ksze ń ) oraz obiektywy immersyjne (du ż ych powi ę ksze ń ). Przy u ż ywaniu tych ostatnich

1 Aberracja sferyczna - poszczególne współosiowe strefy soczewki nieznacznie ró ż ni ą si ę swoimi ogniskowymi;

powoduje to w efekcie nieostro ść obrazu. Aberracja chromatyczna - współczynnik załamania ś wiatła materiału

soczewki zmienia si ę w zale ż no ś ci od długo ś ci przechodz ą cej fali ś wietlnej; efektem tego jest rozszczepienie

przechodz ą cego ś wiatła białego i pojawienie si ę barwnych obwódek wokół konturów obrazu, co pogarsza jego

jako ść .

nale ż y wypełni ć przestrze ń pomi ę dzy preparatem a soczewk ą czołow ą obiektywu olejkiem

immersyjnym, którego współczynnik załamania ś wiatła jest taki sam, jak współczynnik szkła.

Unika si ę w ten sposób ugi ę cia (dyfrakcji) promieni ś wietlnych na granicy szkła i powietrza,

które przy du ż ych powi ę kszeniach niekorzystnie wpływa na jako ść obrazu.

Na obudowie ka ż dego obiektywu znajduj ą si ę podstawowe dane dotycz ą ce jego

charakterystyki: powi ę kszenie oraz apertura numeryczna (p. dalej). Najcz ęś ciej stosowane

powi ę kszenia obiektywów to: 5, 10, 20, 40 (suche), 60 i 90-100 × (immersyjne);

• po ś rednie układy optyczne . Pomi ę dzy obiektywem a okularem znajduj ą si ę zazwyczaj tzw.

po ś rednie układy optyczne, zale ż ne od typu i konstrukcji mikroskopu. Najcz ęś ciej spotykamy

zwierciadła załamuj ą ce promienie ś wietlne pod okre ś lonym k ą tem, zgodnym z k ą tem załamania

tubusa. W mikroskopach badawczych montuje si ę tak ż e układy pryzmatów lub

półprzepuszczalnych luster rozdzielaj ą cych promienie na dwie odr ę bne wi ą zki daj ą ce taki sam

obraz: jedn ą skierowan ą do okularu, a drug ą do poł ą czonego z mikroskopem urz ą dzenia

peryferyjnego (np. aparat fotograficzny, kamera cyfrowa, wideokamera). Mog ą si ę tu równie ż

znajdowa ć soczewki dodatkowo powi ę kszaj ą ce obraz odbierany przez urz ą dzenie peryferyjne,

b ą d ź przez okular.

• okular: ostatni element zespołu optycznego. Jest to układ soczewek działaj ą cy na zasadzie

lupy, za pomoc ą którego ogl ą dany jest obraz mikroskopowy. Powi ę kszenie okularu (5-15 ×)

oznaczone jest na jego obudowie. Specjaln ą odmian ę stanowi ą okulary zapewniaj ą ce

szczególnie du ż e pole widzenia. W najprostszych mikroskopach szkolnych stosuje si ę

pojedynczy okular. W mikroskopach badawczych u ż ywa si ę okularu podwójnego (binokularu)

o regulowanym rozstawie, który umo ż liwia wygodniejsze i mniej m ę cz ą ce wzrok obuoczne

ogl ą danie obrazu.

Elementy składowe mikroskopu ś wietlnego przedstawia ryc. 1.1.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: