Biologia Molekularna Roślin - skrypt do ćwiczeń (2002).pdf - Biologia Molekularna Roslin-Skrypt do cwiczen - bmu23

Skrypt do ćwiczeń

Biologia Molekularna Roślin

Pracownia Biologii Molekularnej Roślin

UW/IBB PAN

Warszawa, 2002

Spis treści

Komputerowa analiza sekwencji........................……………………..…..….6

Izolacja plazmidowego DNA z bakterii. ……………………………...…….6

Enzymy restrykcyjne. Mapy restrykcyjne………………………...…..….…..8

Izolacja DNA z żelu agarozowego………………………………….….…….9

Ligacja DNA………………………………………………………….………10

Transformacja roślin………………………………………………..…..……11

Otrzymywanie DNA z roślin……………………………………….…..…....12

Amplifikacja fragmentu DNA metodą PCR…………………………..……13

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych metodą Southerna………...……….14

Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS…..….15

Western…………………………………………………………………..…..17

Detekcja GUSa…………………………………………………………..…..18

WPROWADZENIE

Tegoroczne ćwiczenia pomyślane są jako całościowy eksperyment. Mamy nadzieje że taki układ ćwi-

czeń pozwoli wam lepiej poznać praktyczne zastosowania omawianych technik biologii molekularnej.

Ćwiczenia oparte będą na analizie genu AtSWI3B (At2G33610) Jest to jedno z białek którego bada-

m zajmuje się nasza pracownia. Białko to jest składnikiem chromatyny, a jego funkcja nie jest do

końca poznana. Mutacje w genie kodującym to białko są letalne w Arabidopsis .

Większość proponowanych przez nas w tym roku ćwiczeń da się wpisać w

jącego na celu analizę promotora genu AtSWI3B przy zastosowaniu genu reporterowego GUS (patrz

schemat 1). Eksperyment taki pozwala poznać wzór ekspresji badanego genu, to znaczy zobaczyć w

jakich częściach rośliny nasze białko występuje. Informacja taka jest bardzo istotna dla planowania dal-

szych eksperymentów. Wynik takiego eksperymentu często pozwala postawić hipotezę na temat funkcji

badanego białka. Na przykład jeżeli nasze białko pojawia się dopiero w starzejących roślinach to mo-

żemy wnioskować, że odpowiada ono za kontrole starzenia roślin.

Podobne wyniki można także uzyskać stosując inne metody,

żda z tych metod ma swoje wady i zalety. Analiza za pomocą genu reporterowego GUS ma następu-

jące zalety:

schemat eksperymentu

jak nothern czy ilościowy RT-PCR.

•

jest stosunkowo prosta,

• jest bardzo czuła,

• pozwala jednocześ

y j

nie analizować ekspresję danego genu zarówno na poziomie całej ro-

ślin ak i t

kankowym,

• pozwala na łat

dą tej metody jest to że analizujemy najczęściej sam promotor bez enhan

ych elementów regulatorowych np. położonych w intronach.

wą analizę ekspresji w różnych warunkach fiziologicznych.

Główną wa

cera, 3’UTRa i

inn

ksperyment nasz można podzielić na kilka etapów przedstawionych na schemacie 1.

tować jego przeklonowanie z plazmidu pAtSWI3B do plazmidu pCAM1381Z. W celu uzyskania

plazmidu pAtSWI3B::GUS. W dalszej części ćwiczenia zajmiemy się trochę samym genem AtSWI3B.

Poszukamy znanych homologów z innych organizmów – być może o którymś wiadomo coś więcej.

Spróbujemy także scharakteryzować domeny tego białka. Zrobimy analizę filogenetyczną rodziny

łek typu SWI3 z Arabidopsis thaliana .

Na drugich ćwiczeniach wyizolujem

a pierwszych ćwiczeniach spróbujemy zidentyfikować in silico promotor genu AtSWI3B i zapro-

jek

bia

y z bakterii plazmid pAtSWI3B niosący sklonowany promotor

genu AtSWI3B oraz plazmid pCAM1381Z. Za pomocą zaplanowanych na poprzednich ćwiczeniach

nie

enzymów restrykcyinych z uzyskanego plazmidu pAtSWI3B wytrawimy promotor AtSWI3B oraz zline-

aryzujemy plazmid pCAM1381Z.

W trakcie trzecich ćwiczeń wyizolujemy z żelu i zligujemy (połączymy) zlinearyzowany plazmid z

promotorem AtSWI3B. Następnie stransformujemy mieszaniną ligacyjną bakterie Esherichia coli.

Na kolejnych czwartych ćwiczeniach będziemy transformować rośliny Arabidopsis thaliana uzyska-

nym uprzednio plazmidem via Agrobacterium tumefaciens .

Uzyskane z transformacji nasiona wysiejemy na pożywkę z odpowiednim antybiotykiem, co pozwoli

wyselekcjonować rośliny transgeniczne. Następnym etapem n

transgeniczności uzyskanych roślin. W tym celu na piątych ćwiczeniach wyizolujemy DNA geno-

mowe z uzyskanych roślin. Posłuży ono (ćwiczenie szóste ) do potwierdzenia transgeniczności metodą

PCR.

Następnym etapem naszych ćwiczeń będzie analiza uzyskanych roślin za pomocą techniki hybrydy-

zacji So

nie transgeniczności badanej rośliny ale pozwala także ustalić, liczbę kopii transgenu wintegrowa-

nych w genom naszej rośliny transgenicznej.

Na ćwiczeniach dziewiątych i dziesiątych wyizolujemy białka z Arabidopsis i rozdzielimy w żelu

oraz zrobimy western używając przeciwciał sk

Na ćwiczeniach jedenastych przeprowadzimy detekcje GUSa w wytypowanych roślinach transge-

nicznych. Detekcja ta polega na barwieniu histochemicznym z użyciem odpowiednich

enie o przeprowadzimy na całych roślinach. Zapoznamy się również z podstawami analizy fenotypu

Arabidopsis . Jest to bardzo potężne narzędzie poznawania funkcji badanego genu, niestety rzadko doce-

niane.

Dwunaste ćwiczenie będzie przeznaczone na podsumowanie całego eksperymentu.

aszego eksperymentu będzie potwierdze-

nie

utherna (ćwiczenia siódme i ósme) . Technika ta pozwala nie tylko na potwierdzenie lub wyklu-

cze

ierowanych przeciwko białku AtSWI3B.

substratów. Bar-

nim wszystkie

wykonywane czynności oraz uzyskane wyniki. Notatki te posłużą do napisania krótkiego opisu prze-

pro

Prosimy, aby w czasie ćwiczeń każdy prowadził dziennik laboratoryjny i notował w

wadzonego eksperymentu.

pAtSWI3B: (w E. coli)

pCAM1381Z ( w E. coli)

Izolacja plazmidu z bakterii

pAtSWI3B:

pCAM1381Z

Trawienie restrykcyjne

Izolacja z ¿elu

AtSWI3B:

:GUS

Ligacja

pAtSWI3B::GUS

Transformacja E. coli

pAtSWI3B::GUS (w E. coli)

Transformacja Agrobacterium

pAtSWI3B::GUS (w Agrobacterium)

Transformacja roœlin

nasiona Arabidopsis thaliana

Selekcja transformantów

Roœlina transgeniczna

Izolacja DNA genomowego

DNA genomowe

PCR

potwierdzenie

transgenicznoœci

7,8

Hybrydyzacja Southerna

sprawdzenie liczby

kopii transgenu

9,10

Western

detekcja bia³ka

Detekcja GUSa

analiza ekspresji genu AtSWI3B

Biologia Molekularna Roślin - skrypt do ćwiczeń (2002).pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: